في السنوات الأخيرة ، أثبت التغليف داخل حويصلات ثنائية الطبقة من الدهون بحجم الخلية أنه طريقة مفيدة لتجارب إعادة التشكيل في المختبر. ستساعد الطريقة التي نقدمها بشكل كبير في إعادة تكوين الهيكل الخلوي في أبحاث الخلايا الاصطناعية. باستخدام هذه الطريقة ، يمكننا توليد حويصلات أحادية اللون عملاقة غير متجانسة الحجم ذات عائد مرتفع.
يتم تقليل وقت توليد الحويصلة بشكل كبير مقارنة بتقنية cDICE التقليدية. يمكننا تغليف أنظمة ترجمة النسخ الخالية من الخلايا المعزولة عن العمليات الخلوية المعقدة التي تحدث في وقت واحد لفحص المسارات الجزيئية. يمكن استخدام هذه الطريقة لتجميع الحد الأدنى من الخلايا الأولية نحو إنشاء خلايا اصطناعية وظيفية.
ابدأ في تحضير خليط من الزيت والدهون عن طريق نقل ديولويل فوسفوكولين والكوليسترول والرودامين PE إلى قارورة زجاجية سعة 15 ملليلتر. ثم ، أضف 0.5 ملليلتر من الكلوروفورم في القارورة. ماصة 7.2 ملليلتر من زيت السيليكون و 1.8 ملليلتر من الزيت المعدني في أنبوب منفصل 15 ملليلتر وتخلط الزيوت عن طريق الدوامة بسرعة 3،200 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثوان.
ثم يضاف خليط الزيت إلى القارورة التي تحتوي على خليط الدهون والكلوروفورم ودوامة الخليط بسرعة 3،200 دورة في الدقيقة لمدة 10 إلى 15 ثانية حتى يصبح مزيج الدهون في الزيت الناتج غائما قليلا ، حيث لا يتم إذابة الدهون بالكامل في الزيت. بعد ذلك ، سونيك الدهون في تشتت الزيت في سونيكتور الحمام مع قوة الموجات فوق الصوتية من 80 واط وتردد التشغيل من 40 كيلوهرتز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إذا لم يتم استخدامه على الفور ، فقم بتخزين خليط الدهون والزيت عند أربع درجات مئوية لمدة 24 ساعة.
لتوليد الحويصلات ، استخدم التجميع مع عمود مطبوع 3D مصنوع من الراتنج الأسود المثبت على لوحة التحريك على الطاولة بسرعة 1،200 دورة في الدقيقة. ثم ، قم بتركيب تغليف واجهة القطيرات المستمرة المطبوعة 3D ، أو غرفة cDICE ، المصنوعة من الراتنج الشفاف على عمود الراتنج الأسود. قم بإعداد محلول الأكتين من 1 إلى 10 ميكرومولار في مخزن الأكتين الكروي ، أو المخزن المؤقت G ، بما في ذلك 10٪ ATO 488 actin.
لبدء بلمرة الأكتين، أضف المخزن المؤقت لبلمرة الأكتين الخيطي، أو المخزن المؤقت F، في محلول الأكتين على الجليد ثم احتفظ بالمحاليل على الجليد لإبطاء بلمرة الأكتين قبل إضافة رابط متقاطع. لإعداد البروتينات المرتبطة بالأكتين ، أو ABPs ، من 1.75 ملليغرام لكل ملليلتر من مخزون اللفافة ، يجب علي 1.57 ميكرولتر من اللفافة في أنبوب دقيق منفصل. بعد ذلك ، أضف 7.5٪ من وسط تدرج الكثافة إلى محلول الأكتين لإنشاء تدرج كثافة بين الطور المائي الخارجي والداخلي وتسهيل الحويصلات أحادية الصفيحة العملاقة أو GUVs ، الترسيب.
ثم ، قم بتوزيع 700 ميكرولتر من الجلوكوز 200 ملليمول كمحلول خارجي في الغرفة. أضف ما يكفي من خليط الدهون والزيت إلى الغرفة حتى يتم ملء 60٪ إلى 80٪ من الغرفة. سيتم تشكيل واجهة بين خليط الدهون والزيت والمحلول الخارجي.
تحضير خليط الأكتين-ABP عن طريق نقل ABPs إلى محلول الأكتين. ثم ، استخدم ماصة عادية من 100 إلى 1000 ميكرولتر لنقل 700 ميكرولتر من خليط زيت الدهون إلى خليط الأكتين - ABP. ماصة لأعلى ولأسفل ثماني مرات لتوليد قطرات مستحلب الدهون أحادية الطبقة بحجم الخلية بقطر 7 إلى 100 ميكرون.
استخدم نفس الماصة التي يتراوح حجمها بين 100 و 1000 ميكرولتر لتوزيع المستحلب بأكمله في الغرفة الدوارة. ستحصل القطرات على نشرة ثانية من الدهون عن طريق عبور الطبقة الأحادية الدهنية في واجهة محلول الزيت الخارجي ، وبالتالي تشكيل GUVs. عند الانتهاء، قم بإزالة الغرفة من لوحة التحريك وتخلص من معظم خليط الدهون والزيت عن طريق إمالة الغرفة في حاوية النفايات.
من خلال إمساك الغرفة مع مواجهة غطائها للداخل ، افتح غطاء الغرفة وقم بإمالة الغرفة قليلا إلى الداخل. ستكون الواجهة بين المحلول الخارجي الذي يحتوي على GUVs وخليط زيت الدهون مرئية من فتحة الغرفة حيث يوجد الغطاء. استخدم ماصة لجمع ما يكفي من المحلول الخارجي الذي يحتوي على GUVs وتوزيع 50 إلى 300 ميكرولتر من المحلول الخارجي في صفيحة 96 بئرا للحصول على كثافة مناسبة من GUVs.
لتصوير GUVs ، قم بإعداد لوحة 96 بئرا على مسرح مجهر مقلوب مجهز بعدسة موضوعية لغمر الزيت 60X. افتح تسلسل صور ذي أهمية في برنامج معالجة الصور ، ImageJ Fiji ، وحدد الصورة بأعلى كثافة. اضغط باستمرار على Control Shift C لفتح نافذة السطوع والتباين والنقر فوق علامة التبويب إعادة تعيين.
في قائمة ImageJ Fiji، انتقل إلى علامتي التبويب تحليل وتعيين مقياس لإدخال المسافة الفعلية المعروفة والوحدة لكل بيكسل صورة. بمجرد الانتهاء من ذلك ، انتقل إلى أزرار الصورة والمكدسات ثم 3D Project لإعادة بناء صورة ثلاثية الأبعاد من مكدس Z. قم بتعيين أسلوب الإسقاط كنقطة سطوع، وتباعد الشرائح بمقدار 0.5 ميكرومتر، ثم حدد علامة المربع Interpolate.
استخدم الخيارات الافتراضية لبقية الإعدادات والتقاط الصور. تظهر الصورة التمثيلية صورة متحدة البؤرة ل GUVs التي تحمل علامة الرودامين PE مع حزم الأكتين الفاكن-المغلفة بها. يجب أن يتم نقل بروتينات ربط الأكتين إلى محلول الأكتين ، ثم إضافة خليط زيت الدهون وتوليد قطرات أحادية الطبقة من الدهون في بضع ثوان لتجنب تكوين شبكات الأكتين قبل التغليف.
لقد استخدمنا تقنية cDICE المعدلة هذه لدراسة أدوار مختلف روابط شبكة الأكتين في تنظيم شبكات الأكتين. نتوقع أن تساعد هذه الطريقة الباحثين الآخرين على استكشاف تنظيم بروتينات الهيكل الخلوي الأخرى.
