Ces dernières années, l’encapsulation dans des vésicules bicouches lipidiques de la taille d’une cellule s’est avérée être une méthode utile pour les expériences de reconstitution in vitro. La méthode que nous présentons aidera grandement à la reconstitution du cytosquelette dans la recherche sur les cellules synthétiques. Avec cette méthode, nous pouvons générer des vésicules unilamellaires géantes de taille hétérogène avec un rendement élevé.
Le temps de génération des vésicules est significativement réduit par rapport à la technique conventionnelle cDICE. Nous pouvons encapsuler des systèmes de transcription-traduction sans cellules isolés de processus cellulaires complexes et simultanés pour examiner les voies moléculaires. Cette méthode peut être utilisée pour assembler des protocellules minimales afin de créer des cellules synthétiques fonctionnelles.
Commencez à préparer un mélange huile-lipide en transférant la dioléoyl-phosphocholine, le cholestérol et la rhodamine PE dans un flacon en verre de 15 millilitres. Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de chloroforme dans le flacon. Pipette 7,2 millilitres d’huile de silicone et 1,8 millilitre d’huile minérale dans un tube séparé de 15 millilitres et mélanger les huiles en vortexant à une vitesse de 3 200 rotations par minute pendant 10 secondes.
Ensuite, ajoutez le mélange d’huile au flacon contenant le mélange lipidique et chloroforme et vortexez le mélange à la vitesse de 3 200 rotations par minute pendant 10 à 15 secondes jusqu’à ce que le mélange lipides-dans-huile résultant soit légèrement trouble, car les lipides ne sont pas complètement dissous dans l’huile. Ensuite, soniquez le lipide dans la dispersion de l’huile dans un sonicateur de bain avec une puissance ultrasonique de 80 watts et une fréquence de fonctionnement de 40 kilohertz pendant 30 minutes à température ambiante. S’il n’est pas utilisé immédiatement, conservez le mélange lipidique-huile à quatre degrés Celsius pendant 24 heures.
Pour générer les vésicules, utilisez l’assemblage avec un arbre imprimé en 3D en résine noire monté sur la plaque d’agitation de paillasse à la vitesse de 1 200 rotations par minute. Ensuite, montez l’encapsulation croisée d’interface de gouttelettes continues imprimée en 3D, ou chambre cDICE, fabriquée à partir de la résine transparente sur l’arbre en résine noire. Préparer une solution d’actine 1 à 10 micromolaires dans un tampon globulaire de l’actine, ou tampon G, y compris 10% d’actine ATO 488.
Pour commencer la polymérisation de l’actine, ajoutez un tampon de polymérisation de l’actine filamenteuse, ou tampon F, dans une solution d’actine sur de la glace, puis conservez les solutions sur de la glace pour ralentir la polymérisation de l’actine avant d’ajouter un réticulant. Pour préparer les protéines de liaison à l’actine, ou ABP, à partir de 1,75 milligramme par millilitre de stock de fascine, aliquote 1,57 microlitre de fascine dans un microtube séparé. Ensuite, ajoutez 7,5% du milieu de gradient de densité dans la solution d’actine pour créer un gradient de densité entre la phase aqueuse externe et interne et faciliter la sédimentation des vésicules unilamellaires géantes ou GUV.
Ensuite, distribuez 700 microlitres de glucose de 200 millimolaires comme solution externe dans la chambre. Ajouter suffisamment de mélange lipid-huile dans la chambre jusqu’à ce que 60% à 80% de la chambre soit remplie. Une interface se formera entre le mélange lipid-huile et la solution externe.
Préparer un mélange actine-ABP en transférant les ABP dans la solution d’actine. Ensuite, utilisez une pipette régulière de 100 à 1 000 microlitres pour transférer les 700 microlitres du mélange lipidique-huile dans le mélange actine-ABP. Pipette de haut en bas huit fois pour générer des gouttelettes d’émulsion monocouche lipidique de la taille d’une cellule d’un diamètre de 7 à 100 microns.
Utilisez la même pipette de 100 à 1 000 microlitres pour distribuer l’émulsion entière dans la chambre rotative. Les gouttelettes acquerront une deuxième feuillet de lipides en croisant la monocouche lipidique à l’interface huile-solution externe, formant ainsi des GUV. Lorsque vous avez terminé, retirez la chambre de la plaque à remuer et jetez la majeure partie du mélange lipidique-huile en inclinant la chambre dans le récipient à déchets.
En tenant la chambre avec son couvercle tourné vers l’intérieur, ouvrez le couvercle de la chambre et inclinez légèrement la chambre vers l’intérieur. L’interface entre la solution extérieure contenant des GUV et le mélange lipid-huile sera visible depuis l’ouverture de la chambre où se trouve le couvercle. Utilisez une pipette pour recueillir suffisamment de solution extérieure contenant des GUV et distribuer 50 à 300 microlitres de la solution extérieure dans une plaque de 96 puits pour obtenir une densité appropriée de GUV.
Pour l’imagerie des GUV, installez la plaque de 96 puits sur la scène d’un microscope inversé équipé d’une lentille d’objectif 60X à immersion dans l’huile. Ouvrez une séquence d’images d’intérêt dans un logiciel de traitement d’image, ImageJ Fiji, et identifiez l’image avec la plus haute intensité. Maintenez la touche Ctrl Maj C enfoncée pour ouvrir la fenêtre de luminosité et de contraste et cliquez sur l’onglet de réinitialisation.
Dans le menu ImageJ Fiji, accédez aux onglets Analyser et Définir l’échelle pour entrer la distance physique et l’unité connues pour chaque pixel d’image. Une fois cela fait, accédez aux boutons Image, Piles, puis Projet 3D pour reconstruire une image 3D à partir de la pile Z. Définissez la méthode de projection sur Point de luminosité, Espacement des tranches sur 0,5 micromètre, puis cochez la case Interpoler.
Utilisez les options par défaut pour le reste des paramètres et capturez des images. L’image représentative montre une image confocale de GUV marqués rhodamine PE avec des faisceaux de fascine-actine encapsulés. Le transfert des protéines de liaison à l’actine dans la solution d’actine, puis l’ajout d’un mélange lipid-huile et la génération de gouttelettes monocouches lipidiques doivent avoir lieu en quelques secondes pour éviter la formation de réseaux d’actine avant l’encapsulation.
Nous avons utilisé cette technique cDICE modifiée pour examiner les rôles des différents réticulants de réseaux d’actine dans l’organisation des réseaux d’actine. Nous nous attendons à ce que cette méthode aide d’autres chercheurs à explorer la régulation d’autres protéines du cytosquelette.
