近年、細胞サイズの脂質二重層小胞内での封入は、in vitro再構成実験のための有用な方法であることが証明されている。我々が提示する方法は、合成細胞研究における細胞骨格再構成に大いに役立つであろう。この方法により、不均質な大きさの巨大な単層小胞を高い収率で生成することができる。
このベシクル生成時間は、従来のcDICE技術に比べて大幅に短縮される。私たちは、分子経路を調べるために、複雑で同時に起こる細胞プロセスから単離された無細胞転写翻訳系をカプセル化することができます。この方法は、機能的な合成細胞の作成に向けて最小限の原始細胞を組み立てるために利用することができる。
ジオレオイル - ホスホコリン、コレステロール、およびローダミンPEを15ミリリットルのガラスバイアルに移すことによって、油 - 脂質混合物の調製を開始する。次いで、バイアルに0.5ミリリットルのクロロホルムを加える。7.2ミリリットルのシリコーンオイルと1.8ミリリットルの鉱物油を別の15ミリリットルのチューブに入れ、毎分3,200回転の速度で10秒間ボルテックスしてオイルを混合します。
次いで、脂質とクロロホルム混合物とを含むバイアルに油混合物を添加し、得られた脂質が油中に完全に溶解しないように、毎分200回転の速度で混合物を10〜15秒間ボルテックスする。次に、80ワットの超音波パワーと室温で30分間40キロヘルツの動作周波数で、浴中超音波処理機で油分散液中の脂質を超音波処理します。すぐに使用しない場合は、脂質 - 油混合物を摂氏4度で24時間保存してください。
ベシクルを生成するには、黒い樹脂で作られた3Dプリントシャフトをベンチトップの攪拌プレートに毎分1,200回転の速度で取り付けたアセンブリを使用します。次に、透明な樹脂で作られた3Dプリントされた連続液滴界面交差カプセル化、またはcDICEチャンバを黒い樹脂シャフトに取り付けます。10%ATO488アクチンを含む球状アクチン緩衝液、またはG緩衝液中の1〜10マイクロモルのアクチン溶液を調製する。
アクチン重合を開始するには、氷上のアクチン溶液に糸状アクチン重合緩衝液またはF緩衝液を添加し、次いで架橋剤を添加する前に溶液を氷上に保持してアクチン重合を遅くする。アクチン結合タンパク質、またはABPsを、1ミリリットルのファシンストックあたり1.75ミリグラムから調製するために、別のマイクロチューブに1.57マイクロリットルのファシンをアリコートする。次に、7.5%の密度勾配媒体をアクチン溶液に添加して、外側水相と内水相の間に密度勾配を作成し、巨大な単層小胞またはGUVsの沈降を促進する。
次いで、外側溶液として700マイクロリットルの200ミリモルグルコースをチャンバーに分配する。チャンバーの60%〜80%が充填されるまで、十分な脂質 - 油混合物をチャンバーに加える。脂質 - 油混合物と外側の溶液との間に界面が形成される。
ABPsをアクチン溶液に移すことによってアクチン-ABP混合物を調製する。次に、通常の100〜1,000マイクロリットルのピペットを使用して、700マイクロリットルの脂質 - 油混合物をアクチン−ABP混合物に移す。ピペットを8回上下させて、直径7〜100ミクロンの細胞サイズの脂質単層エマルジョン液滴を生成した。
同じ100~1,000マイクロリットルのピペットを使用して、エマルジョン全体を回転チャンバーに分配します。液滴は、油-外溶液界面で脂質単分子膜を横切ることによって脂質の第2の小葉を獲得し、それによってGUVを形成する。完了したら、チャンバーを攪拌プレートから取り出し、廃容器内のチャンバーを傾けて脂質 - 油混合物の大部分を廃棄する。
蓋を内側に向けてチャンバーを保持し、チャンバーの蓋を開き、チャンバーを内側にわずかに傾けます。GUVを含む外側溶液と脂質 - 油混合物との間の界面は、蓋が配置されているチャンバ開口部から見えるであろう。ピペットを使用してGUVを含む十分な外側溶液を収集し、50〜300マイクロリットルの外側溶液を96ウェルプレートに分配して、適切な密度のGUVを得る。
GUVを撮像するには、油浸60倍の対物レンズを備えた倒立顕微鏡のステージに96ウェルプレートを設置します。画像処理ソフトウェア ImageJ Fiji で目的の画像シーケンスを開き、最も高い強度の画像を特定します。コントロールシフトCを押しながら明るさとコントラストのウィンドウを開き、リセットタブをクリックします。
ImageJ Fiji メニューの [分析] タブと [スケールの設定] タブに移動して、各画像ピクセルの既知の物理的な距離と単位を入力します。完了したら、[イメージ]、[スタック]、および [3D プロジェクト] ボタンに移動して、Z スタックから 3D イメージを再構築します。投影方法を「輝度ポイント」に設定し、「スライス間隔」を 0.5 マイクロメートルに設定し、「補間」ボックスにチェックマークを付けます。
残りの設定にはデフォルトのオプションを使用し、画像をキャプチャします。代表的な画像は、封入されたファシン−アクチン束を有するローダミンPE標識GUVの共焦点画像を示す。アクチン結合タンパク質をアクチン溶液に移し、次いで脂質 - 油混合物を添加し、脂質単層液滴の生成は、カプセル化の前にアクチンネットワークの形成を避けるために数秒で起こるべきである。
我々は、この改変cDICE技術を用いて、アクチンネットワークの組織化における異なるアクチンネット架橋剤の役割を調べた。この方法が、他の研究者が他の細胞骨格タンパク質の調節を探索するのに役立つと期待しています。
