المجهر الإلكتروني المبرد أحادي الجسيمات هو طريقة للتحديد المنظم للجزيئات الكبيرة عند دقة ذرية قريبة. تتوفر حزم برامج متعددة لمعالجة الصور وحسابات البنية ، ولكن النتيجة على خرائط 3D غالبا ما تختلف في الجودة والدقة بسبب الاختلافات في الخوارزميات المطبقة أثناء الحسابات. وبالتالي ، فإن استخدام مجموعة من البرامج المختلفة غالبا ما يكون مفيدا لتحقيق أفضل النتائج.
يوجه هذا البروتوكول المستخدمين للتنقل في سير العمل عبر ثلاث منصات مختلفة لمعالجة cryo-EM: CryoSPARC و RELION و Scipion. سنوضح كيفية استخدام خط الأنابيب هذا للحصول على بنية عالية الدقة للفيروس المرتبط بالغدي وهو ناقل يستخدم على نطاق واسع للعلاج الجيني. بعد فتح CryoSPARC v3 في متصفح ويب وإنشاء مساحة عمل للمشروع ، انتقل إلى مساحة العمل الجديدة وافتح منشئ الوظائف على اللوحة اليمنى.
انقر فوق استيراد الأفلام وقم بتوفير مسار الأفلام والحصول على مسار ملف مرجعي. ثم قم بتعيين معلمات الاستحواذ. بعد ذلك ، انقر فوق قائمة الانتظار ، وحدد مسارا لتشغيل المهمة ومساحة عمل وانقر فوق إنشاء.
افتح تصحيح حركة التصحيح وبطاقة مهمة استيراد الأفلام. ثم اسحب إخراج imported_movies إلى العنصر النائب للأفلام في المهمة الجديدة وقم بانتظار المهمة. لتنفيذ دالة نقل التباين أو تقدير CTF، افتح تقدير CTF للتصحيح.
أدخل الصور المجهرية التي تم إنشاؤها وقم بانتظار المهمة. لفحص الصور المجهرية المتوسطة والمصححة من CTF وتحديد مجموعة فرعية لمزيد من المعالجة ، افتح التعرضات التنظيمية ، وأدخل التعرضات التي تم الحصول عليها من الخطوة السابقة وقم بانتظار المهمة. بعد دخول الوظيفة في وضع الانتظار ، انقر فوق علامة التبويب التفاعلية على بطاقة الوظيفة.
اضبط عتبات المعلمات واقبل أو ارفض الصور المجهرية الفردية لمزيد من المعالجة. أثناء معالجة البيانات الحالية ، اضبط العتبة العليا للاستجماتيزم على 400 أنغستروم ، ودقة CTF تناسب خمسة أنغستروم وسماكة الجليد النسبية إلى اثنين. ثم انقر فوق تم لتحديد المجهر للمعالجة النهائية.
للانتقاء اليدوي، افتح أداة الانتقاء اليدوي. أدخل التعرضات المقبولة وقم بانتظار المهمة. ثم انقر فوق علامة التبويب التفاعلية ، واضبط حجم الصندوق على 300 بكسل وانقر على بضع مئات من الجسيمات عبر صور مجهرية متعددة ، وتجنب الجسيمات المتداخلة.
بمجرد الانتهاء من الاختيار ، انقر فوق الانتهاء من اختيار جزيئات الاستخراج. بعد ذلك ، لإنشاء قوالب لاختيار الجسيمات تلقائيا ، انقر فوق تصنيف 2D وأدخل اختيارات الجسيمات التي تم إنشاؤها. ثم قم بتغيير عدد فئات 2D إلى 10 وقم بانتظار المهمة.
بعد ذلك ، افتح فئات 2D المحددة وأدخل الجسيمات ومتوسطات الفئات التي تم الحصول عليها في الخطوة السابقة. ثم انقر فوق علامة التبويب التفاعلية ، وحدد فئات 2D التمثيلية مع نسبة إشارة إلى ضوضاء جيدة وانقر فوق تم. لاختيار الجسيمات المستندة إلى القالب ، افتح منتقي القوالب وأدخل فئات 2D المحددة والرسوم البيانية المجهرية.
ثم اضبط قطر الجسيم على 220 أنغستروم واصطف في قائمة انتظار المهمة. أخيرا ، افتح المستخلص من الصور المجهرية وأدخل الصور المجهرية والجسيمات التي تم الحصول عليها من فحص مختارات الجسيمات. ثم اضبط حجم المربع المستخرج على 300 بكسل وقم بانتظار المهمة.
للتصنيف 2D ، انقر فوق تصنيف 2D وأدخل الجسيمات المستخرجة. ثم قم بتعيين عدد فئات 2D إلى 50 وقم بانتظار المهمة. بعد ذلك ، افتح فئات 2D المحددة وأدخل الجسيمات التي تم الحصول عليها ومتوسطات الفئات.
انقر فوق علامة التبويب التفاعلية. اختر فئات 2D بناء على الدقة وعدد الجسيمات في الفئة وانقر فوق تم. لإنشاء وحدة تخزين 3D أولية ، افتح إعادة بناء ab-initio وأدخل الجسيمات من التصنيف النهائي 2D.
ثم اضبط التماثل على icosahedral واصطف في قائمة الانتظار. بعد ذلك ، افتح الصقل المتجانس ، وأدخل الحجم من الخطوة السابقة والجسيمات من التصنيف النهائي 2D. ثم قم بتغيير التماثل وقم بانتظار المهمة.
عند الانتهاء من المهمة ، افحص ارتباط غلاف فورييه أو منحنى FSC وقم بتنزيل وحدة التخزين لفحصها في UCSF Chimera. في CryoSPARC v3 ، افتح بطاقة المهمة الخاصة بوظيفة فئة 2D المحددة من التصنيف ثنائي الأبعاد النهائي. ثم في علامة التبويب التفاصيل ، انقر فوق مهمة التصدير.
باستخدام PyEM ، قم بتحويل particles_exported. ملف cs إلى تنسيق نجمة عن طريق تنفيذ الأمر المشار إليه. بعد النقر فوق استخراج الجسيمات، في علامة التبويب إدخال/إخراج، أدخل المجهر والإحداثيات المصححة من CTF.
ثم انقر فوق علامة التبويب استخراج ، وقم بتغيير حجم مربع الجسيمات إلى 300 بكسل وقم بتشغيل المهمة. لتحسين ثلاثي الأبعاد ، استخدم الخريطة التي تم إنشاؤها في CryoSPARC v3 كنموذج أولي في RELION-3. حدد طريقة الاستيراد وقم بتعيين المعلمات المشار إليها في علامة التبويب إدخال/إخراج.
ثم في علامة التبويب الآخرين ، حدد خريطة CryoSPARC v3 كملف إدخال ، وقم بتغيير نوع العقدة إلى مرجع ثلاثي الأبعاد وقم بتشغيل المهمة. بعد ذلك ، حدد التحسين التلقائي 3D وفي علامة التبويب I / O ، قم بتعيين صور الإدخال كجسيمات. ملف نجمة من مهمة التحديد الأخيرة.
استخدم إعادة بناء CryoSPARC v3 كخريطة مرجعية ، وانقر فوق علامة التبويب المرجعية وقم بتغيير مرشح التمرير المنخفض الأولي إلى 50 angstroms والتماثل إلى icosahedral. ثم في علامة التبويب التحسين ، قم بتغيير قطر القناع إلى 280 angstroms وقم بتشغيل المهمة. للمعالجة اللاحقة ، انقر فوق المعالجة اللاحقة.
وفي علامة التبويب الإدخال/الإخراج، أدخل الخرائط النصفية والقناع اللذين تم إنشاؤهما واضبط حجم البكسل المعاير على 1.045 أنغستروم. ثم في علامة التبويب شحذ ، لتقدير B-factor تلقائيا ، أدخل نعم. للحصول على أقل دقة لملاءمة B التلقائية، أدخل 10.
ولاستخدام عامل B الخاص بك ، رقم الإدخال. أخيرا ، في علامة التبويب عامل التصفية ، قم بتعيين تخطي ترجيح FSC إلى لا وقم بتشغيل المهمة. للتدريب على التلميع ، افتح تلميع بايزي.
وفي علامة التبويب الإدخال/الإخراج، أدخل الصور المجهرية والجسيمات وPostProcess المصححة للحركة. ملف نجمة تم الحصول عليه سابقا. انقر فوق علامة التبويب التدريب واضبط معلمات التدريب المثلى على نعم ، جزء من وحدات بكسل فورييه للاختبار إلى 0.5 واستخدم هذا العدد الكبير من الجسيمات إلى 5000.
ثم قم بتشغيل الوظيفة. بمجرد الانتهاء من مهمة التدريب ، انقر فوق تلميع بايزي. ثم في علامة التبويب التدريب ، قم بتعيين معلمات التدريب المثلى إلى لا.
حدد علامة التبويب البولندية وفي ملف المعلمة المحسن ، حدد المسار إلى opt_params_all_groups. txt من الخطوة السابقة وانقر على تشغيل. لتقدير انحرافات الترتيب الأعلى، افتح تحسين CTF.
وفي علامة التبويب الإدخال/الإخراج ضمن الجسيمات، حدد المسار إلى ملف النجمة الذي يحتوي على جزيئات مصقولة من وظيفة 3D المكررة الأخيرة. ثم ضمن ملف STAR بعد العملية، قم بتعيين المسار إلى الإخراج من أحدث مهمة ما بعد المعالجة. بعد ذلك ، حدد علامة التبويب ملائمة واضبط تقدير التكبير المتباين إلى لا.
أداء CTF معلمة مناسبة ل لا. تقدير إمالة الشعاع إلى نعم. أيضا تقدير trefoil إلى نعم.
وتقدير انحرافات من الدرجة الرابعة إلى نعم. ثم قم بتشغيل الوظيفة. لمزيد من تحسين خريطة RELION-3 والتحقق من صحتها ، قم بتشغيل Scipion 3 وإنشاء مشروع جديد.
في لوحة البروتوكولات اليمنى، حدد القائمة المنسدلة الواردات وانقر على استيراد الجسيمات. تغيير استيراد المعلمات من إلى RELION-3 وملف نجمة إلى postprocess.star. ثم حدد معلمات الاستحواذ كما هو موضح سابقا وانقر فوق تنفيذ.
بعد ذلك ، انقر فوق القائمة المنسدلة الواردات وحدد أحجام الاستيراد. ضمن استيراد من، أعط المسار إلى خريطة RELION-3، وقم بتغيير معدل أخذ العينات بحجم البكسل إلى 1.045 أنغستروم لكل بكسل ونفذ. لإجراء محاذاة شاملة، حدد القائمة المنسدلة تنقيح من لوحة البروتوكولات وانقر على xmipp3-highres.
أدخل الجسيمات والأحجام المستوردة من الخطوات السابقة كصور كاملة الحجم وأحجام أولية على التوالي واضبط مجموعة التماثل على icosahedral. ثم في علامة التبويب محاذاة الصورة ضمن التعيين الزاوي ، اختر عالمي ، واضبط الدقة القصوى المستهدفة على ثلاثة angstroms وقم بتشغيل المهمة. لإجراء محاذاة محلية، حدد xmipp3-highres عمومي، وقم بتغيير المتابعة من التشغيل السابق إلى نعم وحدد المهمة السابقة.
ثم في علامة التبويب التعيين الزاوي ، قم بتغيير محاذاة الصورة إلى المحلية واضبط الحد الأقصى للدقة المستهدفة على 2.1 angstroms. بعد الانتهاء ، في نافذة نتائج xmipp3-highres ، انقر فوق مخططات دقة العرض لمعرفة كيف تغيرت FSC بعد التحسين وانقر فوق الرسم البياني للرسم مع التغييرات الزاوية لمعرفة ما إذا كانت تعيينات زاوية أويلر قد تغيرت. افحص مستوى الصوت في UCSF Chimera.
قم بالتكبير والبحث عن ميزات عالية الدقة. تم اختيار الصور المجهرية ذات الملاءمة الجيدة ل CTF والاستجماتيزم المنخفض لمزيد من المعالجة ، في حين تم التخلص من تلك التي تعاني من الاستجماتيزم العالي والمصادرة. تم اختيار متوسطات فئة 2D التي تحتوي على فئات محددة جيدا ، وتم رفض تلك ذات الدقة المنخفضة والضوضاء والجسيمات الجزئية.
تظهر هنا مناطق خريطة المجهر الإلكتروني المبرد المزودة بإحداثيات ذرية لفيروس مرتبط بالغدي. تسمح كثافات EM المحددة جيدا بتركيب سلاسل جانبية من الأحماض الأمينية الفردية وجزيئات الماء وأيونات المغنيسيوم. تشير منحنيات FSC المحسوبة باستخدام CryoSPARC v3 وRELION-3 وScipion إلى زيادة الدقة عبر سير العمل ، وتقديرات الدقة عند أربع شرائح مختلفة من خلال الهياكل وتوضح الرسوم البيانية للدقة التحسن التدريجي في الدقة المحلية بين الخرائط طوال سير العمل.
أدى الجمع بين خوارزميات معالجة cryo-EM من CryoSPARC و RELION-3 و Scipion و Phoenix إلى زيادة دقة هياكل الفيروسات المرتبطة بالغدية من 2.9 إلى 2.3 angstroms عبر خط أنابيب المعالجة. من المهم أن نتذكر أن المعلمات المحددة في كل خطوة تعتمد على العينة والمجهر. بالإضافة إلى ذلك ، تعتمد القدرة على الوصول إلى دقة عالية بشكل كبير على جودة العينة والبيانات الخام.
في هذا الفيديو، نقدم سير عمل SP القوي لمعالجة بيانات cryo-EM عبر منصات البرامج المختلفة. باستخدام هذا النهج ، يمكن للمرء تنفيذ خوارزميات لبرامج متعددة لتحسين هياكل cryo والتحقق من صحتها. يمكن تطبيق سير العمل هذا على حسابات البنية لمجموعة واسعة من التجميعات الجزيئية الكبيرة.
