Одночастичная криоэлектронная микроскопия — метод структурированных определений макромолекул с разрешением, близким к атомному. Для обработки изображений и расчета структуры доступно несколько пакетов программного обеспечения, но результат на 3D-картах часто различается по качеству и разрешению из-за различий в алгоритмах, применяемых во время вычислений. Таким образом, использование комбинации различных программ часто полезно для достижения оптимальных результатов.
Этот протокол помогает пользователям перемещаться по трем различным платформам обработки крио-ЭМ: CryoSPARC, RELION и Scipion. Мы продемонстрируем, как использовать этот конвейер для получения структуры с высоким разрешением аденоассоциированного вируса, который является широко используемым вектором для генной терапии. После открытия CryoSPARC v3 в веб-браузере и создания рабочей области для проекта перейдите к новой рабочей области и откройте конструктор заданий на правой панели.
Нажмите на импорт фильмов и укажите путь к фильмам и путь к файлу ссылки. Затем задайте параметры сбора. Затем щелкните очередь, выберите полосу для запуска задания и рабочую область и нажмите кнопку создать.
Откройте исправление движения патча и карточку заданий импорта фильмов. Затем перетащите выходные данные imported_movies в заполнитель movies на новом задании и поставьте задание в очередь. Для выполнения функции переноса контраста или оценки CTF откройте патч CTF оценки.
Введите сгенерированные микроснимки и поставьте задание в очередь. Чтобы проверить усредненные и ctF скорректированные микроснимки и выбрать подмножество для дальнейшей обработки, откройте кураторские экспозиции, введите экспозиции, полученные на предыдущем шаге, и поставьте задание в очередь. После того, как задание перейдет в режим ожидания, перейдите на интерактивную вкладку в карточке задания.
Настройте пороговые значения параметров и принимайте или отклоняйте отдельные микроснимки для дальнейшей обработки. При обработке текущих данных установили верхний порог астигматизма в 400 ангстрем, CTF подогнали разрешение до пяти ангстрем, а относительную толщину льда до двух. Затем нажмите «Готово», чтобы выбрать микроснимки для последующей обработки.
Для ручного выбора откройте средство выбора вручную. Введите принятые экспозиции и поставьте задание в очередь. Затем нажмите на интерактивную вкладку, установите размер коробки на 300 пикселей и нажмите на несколько сотен частиц на нескольких микрофотографиях, избегая перекрывающихся частиц.
Закончив с выбором, нажмите на готовые частицы экстракта. Затем, чтобы сгенерировать шаблоны для автоматического отбора частиц, нажмите на 2D-классификацию и введите сгенерированные пики частиц. Затем измените число 2D-классов на 10 и поставьте задание в очередь.
Затем откройте выбранные 2D-классы и введите частицы и средние значения классов, полученные на предыдущем шаге. Затем нажмите на интерактивную вкладку, выберите репрезентативные 2D-классы с хорошим соотношением сигнал/шум и нажмите готово. Для выбора частиц на основе шаблона откройте средство выбора шаблонов и введите выбранные 2D-классы и микроснимки.
Затем установите диаметр частиц в 220 ангстрем и поставьте задание в очередь. Наконец, откройте извлечение из микроснимков и введите микроснимки и частицы, полученные в результате проверки частиц. Затем установите размер извлеченного поля равным 300 пикселям и поставьте задание в очередь.
Для 2D-классификации нажмите на 2D-классификацию и введите извлеченные частицы. Затем установите число 2D-классов равным 50 и поставьте задание в очередь. Далее откройте выбранные 2D классы и введите полученные частицы и средние классы.
Перейдите на интерактивную вкладку. Выберите 2D-классы на основе разрешения и количества частиц в классе и нажмите «Готово». Чтобы сгенерировать начальный 3D-объем, откройте ab-initio реконструкцию и введите частицы из окончательной 2D-классификации.
Затем настройте симметрию на икосаэдрическую и поставьте задание в очередь. Затем откройте однородную очистку, введите объем с предыдущего шага и частицы из окончательной 2D-классификации. Затем измените симметрию и поставьте задание в очередь.
Когда задание будет завершено, проверьте корреляцию оболочки Фурье или кривую FSC и загрузите том для изучения в UCSF Chimera. В CryoSPARC v3 откройте карточку заданий выбранного задания 2D-класса из окончательной 2D-классификации. Затем на вкладке подробностей нажмите на задание экспорта.
Используя PyEM, преобразуйте particles_exported. cs файл в звездный формат путем выполнения указанной команды. После нажатия на извлечение частиц на вкладке Ввода-вывода введите скорректированные CTF микроснимки и координаты.
Затем перейдите на вкладку извлечения, измените размер поля частиц на 300 пикселей и запустите задание. Для 3D-уточнения используйте карту, сгенерированную в CryoSPARC v3, в качестве исходной модели в RELION-3. Выберите метод импорта и задайте указанные параметры на вкладке Ввод-вывод.
Затем на вкладке другие выберите карту CryoSPARC v3 в качестве входного файла, измените тип узла на 3D-ссылку и запустите задание. Затем выберите автообработку 3D и на вкладке Ввод-вывод установите входные изображения в качестве частиц. звездный файл из последнего задания выбора.
Используйте реконструкцию CryoSPARC v3 в качестве эталонной карты, нажмите на вкладку ссылки и измените начальный фильтр нижних частот на 50 ангстрем, а симметрию на икосаэдрический. Затем на вкладке оптимизации измените диаметр маски на 280 ангстрем и запустите задание. Для постобработки нажмите на постобработку.
А на вкладке ввода-вывода введите созданные полукарты и маску и установите калиброванный размер пикселя равным 1,045 ангстрема. Затем на вкладке «Резкость» для автоматической оценки B-фактора введите «Да». Для минимального разрешения для автоматической подгонки B введите 10.
А для использования собственного B-фактора, ввода нет. Наконец, на вкладке фильтра установите для параметра пропустить взвешивание FSC значение no и запустите задание. Для обучения полировке откройте байесовскую полировку.
А на вкладке «Ввод-вывод» введите микроснимки с поправкой на движение, частицы и PostProcess. звездный файл, полученный ранее. Перейдите на вкладку обучения и установите оптимальные параметры обучения да, долю пикселей Фурье для тестирования в 0,5 и используйте это количество частиц в 5 000.
Затем запустите задание. Как только учебная работа будет завершена, нажмите на байесовскую полировку. Затем во вкладке «Обучение» установите оптимальные параметры тренировки на «Нет».
Выберите вкладку polish и в файле оптимизированных параметров укажите путь к opt_params_all_groups. txt файл из предыдущего шага и нажмите на запуск. Чтобы оценить аберрации более высокого порядка, откройте уточнение CTF.
А на вкладке «Ввод-вывод» в разделе «Частицы» выберите путь к звездному файлу, содержащему отполированные частицы из недавнего усовершенствованного 3D-задания. Затем в postprocess-файле STAR задайте путь к выходным данным последнего задания постобработки. Затем выберите вкладку «Подгонка» и установите для параметра «Оценка анизотропного увеличения» значение «Нет».
Выполните подгонку параметра CTF к no. Оцените ширину до да. Также оцените трилистник на да.
И оцените аберрации четвертого порядка до да. Затем запустите задание. Для дальнейшего уточнения и проверки карты RELION-3 запустите Scipion 3 и создайте новый проект.
На левой панели протоколов выберите выпадающий список импорта и нажмите на импорт частиц. Измените импорт параметров из RELION-3 и звездочку в postprocess.star. Затем укажите параметры сбора, как показано ранее, и нажмите «Выполнить».
Затем нажмите на раскрывающийся список импорта и выберите тома импорта. При импорте из укажите путь к карте RELION-3, измените частоту дискретизации размера пикселя до 1,045 ангстрем на пиксель и выполните. Чтобы выполнить глобальное выравнивание, выберите раскрывающееся меню уточнения на панели протоколов и щелкните xmipp3-highres.
Введите импортированные частицы и объемы из предыдущих шагов в виде полноразмерных изображений и начальных объемов соответственно и установите группу симметрии в икосаэдрическое. Затем на вкладке выравнивания изображения в разделе угловое назначение выберите глобальный, установите максимальное целевое разрешение в три ангстрема и запустите задание. Чтобы выполнить локальное выравнивание, выберите xmipp3-highres global, измените продолжить с предыдущего запуска на yes и выберите предыдущее задание.
Затем на вкладке углового назначения измените выравнивание изображения на локальное и установите максимальное целевое разрешение равным 2,1 ангстрема. После завершения в окне результатов xmipp3-highres нажмите на графики разрешения дисплея, чтобы увидеть, как изменился FSC после уточнения, и нажмите на гистограмму графика с угловыми изменениями, чтобы увидеть, изменились ли назначения углов Эйлера. Проверьте объем в Химере UCSF.
Увеличьте масштаб и найдите функции с высоким разрешением. Микроснимки с хорошей посадкой CTF и низким астигматизмом были отобраны для дальнейшей обработки, в то время как снимки с высоким астигматизмом и форфейтом были отброшены. Были выбраны средние значения 2D-классов, содержащие четко определенные классы, а также классы с низким разрешением, шумом и частичными частицами.
Здесь показаны области криоэлектронной микроскопической карты, снабженные атомными координатами аденоассоциированного вируса. Четко определенные плотности ЭМ позволяют подгонять боковые цепи отдельных аминокислот, молекул воды и ионов магния. Кривые FSC, рассчитанные с использованием CryoSPARC v3, RELION-3 и Scipion, указывают на увеличение разрешения в рабочем процессе, оценки разрешения на четырех различных срезах через структуры и гистограммы разрешения демонстрируют постепенное улучшение локального разрешения между картами на протяжении всего рабочего процесса.
Объединение алгоритмов крио-ЭМ обработки CryoSPARC, RELION-3, Scipion и Phoenix привело к увеличению разрешения аденоассоциированных вирусных структур с 2,9 до 2,3 ангстрем по всему технологическому конвейеру. Важно помнить, что параметры, указанные на каждом этапе, зависят от образца и микроскопа. Кроме того, способность достичь высокого разрешения в значительной степени зависит от качества выборки и необработанных данных.
В этом видео мы представляем надежный рабочий процесс SP для обработки крио-EM данных на различных программных платформах. Используя этот подход, можно реализовать алгоритмы для нескольких программ для уточнения и проверки криоструктур. Этот рабочий процесс может быть применен к расчетам структуры широкого спектра макромолекулярных сборок.
