מיקרוסקופיה קריו-אלקטרון חד-חלקיקית היא השיטה לקביעת קביעות מובנות של מקרומולקולות ברזולוציה אטומית קרובה. חבילות תוכנה מרובות זמינות לעיבוד תמונה וחישובי מבנה, אך התוצאה במפות תלת-ממדיות משתנה לעתים קרובות באיכות וברזולוציה בשל ההבדלים באלגוריתמים המוחלים במהלך חישובים. לכן, באמצעות שילוב של תוכניות שונות הוא לעתים קרובות מועיל כדי להשיג את התוצאות האופטימליות.
פרוטוקול זה מנחה משתמשים לנווט בזרימת עבודה בשלוש פלטפורמות עיבוד שונות של cryo-EM:CryoSPARC, RELION ו- Scipion. אנו נדגים כיצד להשתמש בצינור זה כדי להשיג מבנה ברזולוציה גבוהה של הנגיף הקשור לאדנו שהוא וקטור נפוץ לטיפול גנטי. לאחר פתיחת CryoSPARC v3 בדפדפן אינטרנט ויצירת סביבת העבודה עבור הפרוייקט, נווט לסביבת העבודה החדשה ופתח את בונה המשימות בחלונית הימנית.
לחץ על ייבוא סרטים וספק את נתיב הסרטים וקבל נתיב קובץ הפניה. לאחר מכן הגדר את פרמטרי הרכישה. לאחר מכן, לחץ על התור, בחר נתיב להפעלת המשימה וסביבת העבודה ולחץ על צור.
פתח את תיקון תנועת התיקון ואת כרטיס העבודה של ייבוא סרטים. לאחר מכן גרור את הפלט imported_movies למציין המיקום של הסרטים במשימה החדשה ועמד בתור למשימה. כדי לבצע את פונקציית העברת הניגודיות או את הערכת CTF, פתח את הערכת CTF של תיקון.
הזן את המיקרוגרפים שנוצרו והעמד את המשימה בתור. כדי לבדוק את המיקרוגרפים המתוקנים הממוצעים וה- CTF ולבחור קבוצת משנה לעיבוד נוסף, פתח חשיפות אוצרות, הזן את החשיפות שהושגו מהשלב הקודם ועמד בתור את המשימה. לאחר שהעבודה נכנסת למצב המתנה, לחץ על הכרטיסיה האינטראקטיבית בכרטיס העבודה.
התאם את סף הפרמטרים וקבל או דחה מיקרוגרפים בודדים לצורך עיבוד נוסף. בעת עיבוד הנתונים הנוכחיים, הגדר את הסף העליון של אסטיגמציה ל 400 אנגסטרום, CTF להתאים רזולוציה לחמישה אנגסטרום ועובי קרח יחסי לשניים. לאחר מכן לחץ על נעשה כדי לבחור את המיקרוגרפים לעיבוד במורד הזרם.
לאיסוף ידני, פתח את הבורר הידני. הזן את החשיפות המקובלות והעמד את המשימה בתור. לאחר מכן לחץ על הכרטיסייה האינטראקטיבית, הגדר את גודל התיבה ל -300 פיקסלים ולחץ על כמה מאות חלקיקים על פני מיקרוגרפים מרובים, תוך הימנעות מחלקיקים חופפים.
לאחר סיום עם הבחירה, לחץ על עשה לקטוף חלקיקי תמצית. לאחר מכן, כדי ליצור תבניות לקטיף חלקיקים אוטומטי, לחץ על סיווג דו-ממדי והזן את בחירות החלקיקים שנוצרו. לאחר מכן שנה את מספר המחלקות הדו-ממדיות ל- 10 והעמד את המשימה בתור.
לאחר מכן, פתחו בחר מחלקות דו-ממדיות והזן את החלקיקים ואת ממוצעי המחלקות שהושגו בשלב הקודם. לאחר מכן לחץ על הכרטיסייה האינטראקטיבית, בחר מחלקות דו-ממדיות מייצגות עם יחס אות לרעש טוב ולחץ על סיום. לאיסוף חלקיקים מבוסס תבנית, פתחו את בורר התבניות והאזינו את המחלקות והמיקרוגרפים הדו-ממדיים שנבחרו.
לאחר מכן הגדר את קוטר החלקיקים ל-220 אנגסטרום ותעמוד בתור למשימה. לבסוף, פתחו תמצית ממיקרוגרפים והכניסו את המיקרוגרפים והחלקיקים המתקבלים מבדיקת בחירות חלקיקים. לאחר מכן הגדר את גודל התיבה שחולצה ל- 300 פיקסלים ועמד בתור למשימה.
לסיווג דו-ממדי, לחצו על סיווג דו-ממדי והכניסו את החלקיקים שחולצו. לאחר מכן הגדר את מספר המחלקות הדו-ממדיות ל- 50 והגדר את המשימה בתור. לאחר מכן, פתחו בחר מחלקות דו-ממדיות והזן את החלקיקים המתקבלים ואת ממוצעי המחלקות.
לחץ על הכרטיסיה האינטראקטיבית. בחרו מחלקות דו-ממדיות בהתבסס על הרזולוציה ומספר החלקיקים במחלקה ולחצו על 'בוצע'. כדי ליצור נפח תלת-ממדי ראשוני, פתחו את שחזור ab-initio והזן את החלקיקים מהסיווג הדו-ממדי הסופי.
לאחר מכן התאם את הסימטריה לאיקוסהדרל ועמד בתור למשימה. לאחר מכן, פתח עידון הומוגני, הזן את עוצמת הקול מהשלב הקודם וחלקיקים מהסיווג הדו-ממדי הסופי. לאחר מכן שנה את הסימטריה והעמיד את המשימה בתור בתור.
לאחר סיום המשימה, בדוק את המתאם של מעטפת פורייה או את עקומת FSC והורד את אמצעי האחסון לבדיקה בכימרה של UCSF. ב- CryoSPARC v3, פתח את כרטיס העבודה של משימת המחלקה הדו-ממדית שנבחרה מהסיווג הדו-ממדי הסופי. לאחר מכן, בכרטיסיה פרטים, לחץ על משימת ייצוא.
באמצעות PyEM, המר את particles_exported. תבנית cs file to star על-ידי ביצוע הפקודה שצוינה. לאחר לחיצה על מיצוי חלקיקים, בכרטיסיית הקלט/פלט, הזן את המיקרוגרפים והקואורדינטות המתוקנות של CTF.
לאחר מכן לחץ על כרטיסיית החילוץ, שנה את גודל תיבת החלקיקים ל-300 פיקסלים והפעל את המשימה. עבור עידון תלת-ממדי, השתמש במפה שנוצרה ב- CryoSPARC v3 כמודל ראשוני ב- RELION-3. בחר את שיטת הייבוא והגדר את הפרמטרים שצוינו בכרטיסיה קלט/פלט.
לאחר מכן, בכרטיסיה אחרים, בחר את מפת v3 CryoSPARC כקובץ הקלט, שנה את סוג הצומת להפניה תלת-ממדית והפעל את המשימה. לאחר מכן, בחרו בעידון האוטומטי התלת-ממדי ובכרטיסיית הקלט/פלט, הגדר תמונות קלט כחלקיקים. קובץ כוכב ממשימת הבחירה האחרונה.
השתמש בשחזור v3 CryoSPARC כמפת הייחוס, לחץ על כרטיסיית ההפניה ושנה את מסנן המעבר הנמוך הראשוני ל -50 אנגסטרום וסימטריה לאיקוסהדרל. לאחר מכן, בכרטיסיית המיטוב, שנה את קוטר המסיכה ל- 280 אנגסטרום והפעל את המשימה. לעיבוד פוסט, לחץ על לאחר העיבוד.
ובכרטיסיית הקלט/פלט, הזן את חצאי המפות והמסיכה שנוצרו והגדר את גודל הפיקסלים המכויל ל- 1.045 אנגסטרום. לאחר מכן, בכרטיסיית החידוד, עבור גורם B הערכה באופן אוטומטי, קלט כן. לקבלת הרזולוציה הנמוכה ביותר להתאמת B אוטומטית, קלט 10.
ולשימוש ב-פקטור B משלך, קלט לא. לבסוף, בכרטיסיית המסנן, הגדר דילוג על שקלול FSC ל-לא והפעל את המשימה. לאימוני ליטוש, פתחו את הליטוש הבייסיאני.
ובכרטיסיית הקלט/פלט, הזן את המיקרוגרפים, החלקיקים והפוסט-תהליך המתוקנים בתנועה. קובץ כוכב שהושג בעבר. לחץ על כרטיסיית האימון והגדר את הפרמטרים האופטימליים של הרכבת ל- yes, שבר של פיקסלים של Fourier לבדיקה ל- 0.5 והשתמש בחלקיקים רבים אלה עד 5, 000.
אז תנהל את העבודה. לאחר סיום עבודת האימון, לחץ על ליטוש בייסיאני. לאחר מכן, בכרטיסיית האימון, הגדר את הפרמטרים האופטימליים של הרכבת ל- No.
בחר בכרטיסיית הלק ובקובץ פרמטר ממוטב, ציין את הנתיב opt_params_all_groups. txt קובץ מהשלב הקודם ולחץ על הפעל. כדי להעריך סטיות סדר גבוהות יותר, פתח את עידון CTF.
ובכרטיסיה קלט/פלט תחת חלקיקים, בחר את הנתיב לקובץ הכוכב המכיל חלקיקים מלוטשים ממשימת התלת-ממד המעודנת האחרונה. לאחר מכן, תחת קובץ STAR לאחר תהליך, הגדר את הנתיב לפלט ממשימת הפוסט-עיבוד האחרונה. לאחר מכן, בחר בכרטיסיה התאמה והגדר את ההגדלה האניסוטרופית של הערכה ל'לא'.
בצע התאמת פרמטר CTF ל- No. הערכת beamtilt ל כן. גם להעריך trefoil ל כן.
ולהעריך סטיות מסדר רביעי לכן. אז תנהל את העבודה. כדי למקד ולאמת עוד יותר את מפת RELION-3, הפעל את Scipion 3 וצור פרוייקט חדש.
בחלונית הפרוטוקולים הימנית, בחרו ברשימה הנפתחת 'יבוא' ולחצו על חלקיקי יבוא. שנה את הפרמטרים המיובאים מ- RELION-3 וקובץ כוכב ל- postprocess.star. לאחר מכן ציין את פרמטרי הרכישה כפי שהוכח קודם לכן ולחץ על ביצוע.
לאחר מכן, לחץ על הרשימה הנפתחת של היבוא ובחר אמצעי אחסון לייבוא. תחת ייבוא מ, תן את הנתיב למפת RELION-3, שנה את קצב הדגימה בגודל פיקסל ל- 1.045 אנגסטרום לפיקסל ובצע. כדי לבצע יישור כללי, בחרו בתפריט הנפתח 'מקד' מהחלונית 'פרוטוקולים' ולחצו על xmipp3-highres.
הזן את החלקיקים והנפחים המיובאים מהשלבים הקודמים כתמונות בגודל מלא ובאמצעי אחסון ראשוניים בהתאמה והגדר את קבוצת הסימטריה לאיקוסהדרל. לאחר מכן, בכרטיסיה יישור תמונה תחת הקצאה זוויתית, בחר כללי, הגדר את רזולוציית היעד המרבית לשלושה אנגסטרום והפעל את המשימה. כדי לבצע יישור מקומי, בחר xmipp3-highres כללי, שנה המשך מההפעלה הקודמת ל- yes ובחר את המשימה הקודמת.
לאחר מכן, בכרטיסיה הקצאה זוויתית, שנה את יישור התמונה למקומי והגדר את רזולוציית היעד המרבית ל- 2.1 אנגסטרום. לאחר סיום, בחלון התוצאות xmipp3-highres, לחץ על התוויות רזולוציית תצוגה כדי לראות כיצד ה- FSC השתנה לאחר עידון ולחץ על התוויית היסטוגרמה עם שינויים זוויתיים כדי לראות אם הקצאות הזווית של אוילר השתנו. בדוק את עוצמת הקול בכימרה UCSF.
הגדל את התצוגה וחפש תכונות ברזולוציה גבוהה. מיקרוגרפים עם התאמה טובה CTF ואסטיגמציה נמוכה נבחרו לעיבוד נוסף, בעוד אלה עם אסטיגמציה גבוהה והפסד הושלכו. נבחרו ממוצעי מחלקות דו-ממדיים המכילים מחלקות מוגדרות היטב, ואלה עם רזולוציה נמוכה, רעש וחלקיקים חלקיים נדחו.
אזורים במפת המיקרוסקופיה של קריו-אלקטרון המצוידים בקואורדינטות אטומיות של וירוס הקשור לאדנו מוצגים כאן. צפיפות EM מוגדרת היטב מאפשרת שרשראות צד מתאימות של חומצות אמינו בודדות, מולקולות מים ויוני מגנזיום. עקומות FSC שחושבו באמצעות CryoSPARC v3, RELION-3 ו- Scipion מצביעות על רזולוציה הולכת וגוברת לאורך זרימת העבודה, הערכות רזולוציה בארבע פרוסות שונות דרך המבנים והיסטוגרמה של הרזולוציה ממחישות את השיפור המצטבר ברזולוציה המקומית בין המפות לאורך זרימת העבודה.
שילוב של אלגוריתמי עיבוד קריו-EM של CryoSPARC, RELION-3, Scipion ו- Phoenix הביא לעלייה ברזולוציה של מבני הווירוסים הקשורים לאדנו מ-2.9 ל-2.3 אנגסטרום על פני צינור העיבוד. חשוב לזכור כי הפרמטרים שצוינו בכל שלב הם מדגם ותלוי מיקרוסקופ. בנוסף, היכולת להגיע לרזולוציה גבוהה תלויה מאוד באיכות המדגם ובנתונים הגולמיים.
בסרטון וידאו זה, אנו מציגים את זרימת העבודה החזקה SP לעיבוד נתוני קריו-EM בפלטפורמות תוכנה שונות. באמצעות גישה זו, ניתן ליישם אלגוריתמים עבור תוכניות מרובות כדי לחדד ולאמת מבני קריו. ניתן להחיל זרימת עבודה זו על חישובי מבנה של מגוון רחב של הרכבות מקרומולקולריות.
