Tek parçacıklı kriyo-elektron mikroskobu, makromoleküllerin atomik çözünürlüğe yakın yapılandırılmış tayinleri için kullanılan yöntemdir. Görüntü işleme ve yapı hesaplamaları için birden fazla yazılım paketi mevcuttur, ancak 3D haritalardaki sonuç, hesaplamalar sırasında uygulanan algoritmalardaki farklılıklar nedeniyle genellikle kalite ve çözünürlükte farklılık gösterir. Bu nedenle, farklı programların bir kombinasyonunu kullanmak, en iyi sonuçları elde etmek için genellikle faydalıdır.
Bu protokol, kullanıcıları üç farklı cryo-EM işleme platformunda iş akışında gezinmeye yönlendirir: CryoSPARC, RELION ve Scipion. Gen terapisi için yaygın olarak kullanılan bir vektör olan adeno ilişkili virüsün yüksek çözünürlüklü bir yapısını elde etmek için bu boru hattının nasıl kullanılacağını göstereceğiz. CryoSPARC v3'ü bir web tarayıcısında açtıktan ve proje için çalışma alanını oluşturduktan sonra, yeni çalışma alanına gidin ve sağ paneldeki iş oluşturucuyu açın.
Filmleri içe aktar'a tıklayın ve film yolunu sağlayın ve referans dosya yolunu kazanın. Ardından alma parametrelerini ayarlayın. Ardından, kuyruğa tıklayın, işi çalıştırmak için bir şerit ve bir çalışma alanı seçin ve oluştur'a tıklayın.
Yama hareket düzeltmesini ve filmleri içe aktarma iş kartını açın. Ardından imported_movies çıktısını yeni işteki filmler yer tutucusuna sürükleyin ve işi kuyruğa alın. Kontrast aktarım işlevini veya CTF tahminini gerçekleştirmek için, CTF tahminini açın.
Oluşturulan mikrografları girin ve işi sıraya alın. Ortalama ve CTF düzeltilmiş mikrografları incelemek ve daha sonraki işlemler için bir alt küme seçmek için, pozlamaları açın, önceki adımdan elde edilen pozlamaları girin ve işi sıraya koyun. İş bekleme moduna girdikten sonra, iş kartındaki etkileşimli sekmeye tıklayın.
Parametre eşiklerini ayarlayın ve daha sonraki işlemler için tek tek mikrografları kabul edin veya reddedin. Mevcut verileri işlerken, astigmatizmanın üst eşiğini 400 angstroma, CTF uyum çözünürlüğünü beş angstroma ve nispi buz kalınlığını ikiye ayarlayın. Ardından, aşağı akış işleme için mikrografları seçmek üzere bitti'ye tıklayın.
Manuel tabanlı toplama için, manuel seçiciyi açın. Kabul edilen pozlamaları girin ve işi kuyruğa alın. Ardından etkileşimli sekmeye tıklayın, kutu boyutunu 300 piksele ayarlayın ve üst üste binen parçacıklardan kaçınarak birden fazla mikrografta birkaç yüz parçacığa tıklayın.
Seçim bittiğinde, ekstrakt parçacıklarının toplanması bitti'ye tıklayın. Ardından, otomatik partikül toplama şablonları oluşturmak için, 2B sınıflandırmaya tıklayın ve oluşturulan partikül toplamalarını girin. Ardından 2B sınıf sayısını 10 olarak değiştirin ve işi kuyruğa alın.
Ardından, seçilen 2B sınıfları açın ve önceki adımda elde edilen parçacıkları ve sınıf ortalamalarını girin. Ardından etkileşimli sekmeye tıklayın, iyi bir sinyal-gürültü oranına sahip temsili 2D sınıfları seçin ve bitti'ye tıklayın. Şablon tabanlı parçacık toplama için, şablon seçiciyi açın ve seçilen 2B sınıfları ve mikrografları girin.
Ardından parçacık çapını 220 angstrom olarak ayarlayın ve işi sıraya koyun. Son olarak, mikrograflardan ekstraktı açın ve parçacık toplamalarının incelenmesinden elde edilen mikrografları ve parçacıkları girin. Ardından ayıklanan kutu boyutunu 300 piksel olarak ayarlayın ve işi sıraya alın.
2B sınıflandırma için, 2B sınıflandırmaya tıklayın ve çıkarılan parçacıkları girin. Ardından 2B sınıf sayısını 50 olarak ayarlayın ve işi kuyruğa alın. Ardından, seçilen 2B sınıfları açın ve elde edilen parçacıkları ve sınıf ortalamalarını girin.
İnteraktif sekmesine tıklayın. Sınıftaki çözünürlüğe ve parçacık sayısına göre 2B sınıfları seçin ve bitti'ye tıklayın. İlk 3B hacim oluşturmak için, ab-initio rekonstrüksiyonunu açın ve parçacıkları son 2B sınıflandırmasından girin.
Ardından simetriyi ikosahedral olarak ayarlayın ve işi sıraya koyun. Ardından, homojen arıtmayı açın, önceki adımdan hacmi ve son 2B sınıflandırmadan parçacıkları girin. Ardından simetriyi değiştirin ve işi kuyruğa alın.
İş bittiğinde, Fourier kabuk korelasyonunu veya FSC eğrisini inceleyin ve UCSF Chimera'da incelemek üzere birimi indirin. CryoSPARC v3'te, son 2B sınıflandırmadan seçilen 2B sınıf işin iş kartını açın. Ardından ayrıntılar sekmesinde, işi dışa aktar'a tıklayın.
PyEM'i kullanarak particles_exported dönüştürün. cs dosyasını yıldız formatına getirerek belirtilen komutu çalıştırır. Parçacık ekstraksiyonuna tıkladıktan sonra, G / Ç sekmesinde, CTF düzeltilmiş mikrografları ve koordinatları girin.
Ardından ayıklama sekmesine tıklayın, parçacık kutusu boyutunu 300 piksel olarak değiştirin ve işi çalıştırın. 3B iyileştirme için, CryoSPARC v3'te oluşturulan haritayı RELION-3'te ilk model olarak kullanın. İçe aktarma yöntemini seçin ve G/Ç sekmesinde belirtilen parametreleri ayarlayın.
Ardından diğerleri sekmesinde, giriş dosyası olarak CryoSPARC v3 eşlemesini seçin, düğüm türünü 3B başvuru olarak değiştirin ve işi çalıştırın. Ardından, 3B otomatik iyileştirmeyi seçin ve G/Ç sekmesinde, giriş görüntülerini parçacıklar olarak ayarlayın. son seçim işinden yıldız dosyası.
CryoSPARC v3 rekonstrüksiyonunu referans harita olarak kullanın, referans sekmesine tıklayın ve ilk düşük geçirgen filtreyi 50 angstrom ve simetriyi icosahedral olarak değiştirin. Ardından optimizasyon sekmesinde, maske çapını 280 angstrom olarak değiştirin ve işi çalıştırın. İşlem sonrası için, işlem sonrasına tıklayın.
G/Ç sekmesinde, oluşturulan yarım haritaları ve maskeyi girin ve kalibre edilmiş piksel boyutunu 1.045 angstrom olarak ayarlayın. Ardından, B-faktörünü otomatik olarak tahmin etmek için netleştir sekmesinde evet girin. Otomatik B sığdırma için en düşük çözünürlük için 10 girin.
Ve kendi B faktörünüzü kullanmak için, giriş no. Son olarak, filtre sekmesinde, FSC ağırlığını atla'yı hayır olarak ayarlayın ve işi çalıştırın. Parlatma eğitimi için, Bayes parlatma işlemini açın.
Ve G/Ç sekmesinde, hareket düzeltilmiş mikrografları, parçacıkları ve PostProcess'i girin. daha önce elde edilen yıldız dosyası. Eğitim sekmesine tıklayın ve train optimal parametrelerini evet, test için Fourier piksellerinin fraksiyonunu 0,5 olarak ayarlayın ve bu kadar parçacığı 5.000'e kullanın.
Ardından işi çalıştırın. Eğitim işi bittiğinde, Bayes parlatma üzerine tıklayın. Ardından eğitim sekmesinde, train optimal parametrelerini hayır olarak ayarlayın.
Lehçe sekmesini seçin ve optimize edilmiş parametre dosyasında opt_params_all_groups yolunu belirtin. txt dosyasını önceki adımdan alıp çalıştır'a tıklayın. Daha yüksek dereceli sapmaları tahmin etmek için, CTF iyileştirmesini açın.
Parçacıkların altındaki G/Ç sekmesinde, son rafine edilmiş 3B işinden cilalı parçacıklar içeren yıldız dosyasının yolunu seçin. Ardından, işlem sonrası STAR dosyası altında, en son işlem sonrası işin çıktısının yolunu ayarlayın. Ardından, sığdır sekmesini seçin ve tahmini anizotropik büyütmeyi hayır olarak ayarlayın.
Hayır'a CTF parametresi uydurma işlemini gerçekleştirin. Beamtilt'i evet olarak tahmin edin. Ayrıca trefoil'i evet olarak tahmin edin.
Ve dördüncü dereceden sapmaları evet olarak tahmin edin. Ardından işi çalıştırın. RELION-3 haritasını daha da hassaslaştırmak ve doğrulamak için Scipion 3'ü başlatın ve yeni bir proje oluşturun.
Sol protokoller panelinde, içe aktarmalar açılır menüsünü seçin ve parçacıkları içe aktar'a tıklayın. İçe aktarma parametrelerini RELION-3'e ve yıldız dosyasını postprocess.star olarak değiştirin. Ardından, daha önce gösterildiği gibi edinme parametrelerini belirtin ve yürüt'e tıklayın.
Ardından, içe aktarmalar açılır menüsüne tıklayın ve içe aktarma birimlerini seçin. İçe aktarma altında, RELION-3 haritasının yolunu verin, piksel boyutu örnekleme hızını piksel başına 1,045 angstrom olarak değiştirin ve yürütün. Genel bir hizalama gerçekleştirmek için, protokoller panelinden hassaslaştır açılır menüsünü seçin ve xmipp3-highres'a tıklayın.
Önceki adımlardan içe aktarılan parçacıkları ve hacimleri sırasıyla tam boyutlu görüntüler ve başlangıç hacimleri olarak girin ve simetri grubunu ikosahedral olarak ayarlayın. Ardından, açısal atama altındaki görüntü hizalama sekmesinde, genel'i seçin, maksimum hedef çözünürlüğü üç angstroma ayarlayın ve işi çalıştırın. Yerel hizalama gerçekleştirmek için xmipp3-highres global'i seçin, önceki çalıştırmadan devam'ı evet olarak değiştirin ve önceki işi seçin.
Ardından açısal atama sekmesinde, görüntü hizalamasını yerel olarak değiştirin ve maksimum hedef çözünürlüğü 2,1 angstrom olarak ayarlayın. İşlemi tamamladıktan sonra, xmipp3-highres sonuçlar penceresinde, FSC'nin iyileştirmeden sonra nasıl değiştiğini görmek için ekran çözünürlüğü grafiklerine tıklayın ve Euler açı atamalarının değişip değişmediğini görmek için açısal değişikliklerle grafik histogramına tıklayın. UCSF Chimera'daki hacmi inceleyin.
Yakınlaştırın ve yüksek çözünürlüklü özellikleri arayın. CTF uyumu iyi olan ve düşük astigmatizması olan mikrograflar daha ileri işlemler için seçilirken, yüksek astigmatizma ve kaybedilmesi olanlar atıldı. İyi tanımlanmış sınıfları içeren 2B sınıf ortalamaları seçildi ve düşük çözünürlük, gürültü ve kısmi parçacıklara sahip olanlar reddedildi.
Kriyo-elektron mikroskopi haritasının adeno ile ilişkili bir virüsün atomik koordinatlarıyla donatılmış bölgeleri burada gösterilmiştir. İyi tanımlanmış EM yoğunlukları, bireysel amino asitlerin, su moleküllerinin ve magnezyum iyonlarının yan zincirlerinin takılmasına izin verir. CryoSPARC v3, RELION-3 ve Scipion kullanılarak hesaplanan FSC eğrileri, iş akışı genelinde çözünürlüğün arttığını, yapılar aracılığıyla dört farklı dilimde çözünürlük tahminleri ve çözünürlük histogramları, iş akışı boyunca haritalar arasındaki yerel çözünürlükteki artımlı iyileşmeyi gösterir.
CryoSPARC, RELION-3, Scipion ve Phoenix'in kriyo-EM işleme algoritmalarını birleştirmek, adeno ile ilişkili virüs yapılarının işleme boru hattı boyunca 2.9'dan 2.3 angstromun çözünürlüğünün artmasına neden oldu. Her adımda belirtilen parametrelerin numuneye ve mikroskopa bağlı olduğunu hatırlamak önemlidir. Ek olarak, yüksek çözünürlüğe ulaşma yeteneği büyük ölçüde numunenin ve ham verilerin kalitesine bağlıdır.
Bu videoda, çeşitli yazılım platformlarında kriyo-EM verilerinin işlenmesi için sağlam SP iş akışını sunuyoruz. Bu yaklaşımı kullanarak, kriyo yapılarını hassaslaştırmak ve doğrulamak için birden fazla program için algoritmalar uygulanabilir. Bu iş akışı, çok çeşitli makromoleküler montajların yapı hesaplamalarına uygulanabilir.
