La criomicroscopía electrónica de una sola partícula es el método para determinaciones estructuradas de macromoléculas a una resolución casi atómica. Múltiples paquetes de software están disponibles para el procesamiento de imágenes y cálculos de estructuras, sin embargo, el resultado en los mapas 3D a menudo varía en calidad y resolución debido a las diferencias en los algoritmos aplicados durante los cálculos. Por lo tanto, el uso de una combinación de diferentes programas a menudo es beneficioso para lograr los resultados óptimos.
Este protocolo guía a los usuarios a navegar por el flujo de trabajo a través de tres plataformas de procesamiento crio-EM diferentes: CryoSPARC, RELION y Scipion. Demostraremos cómo utilizar esta tubería para obtener una estructura de alta resolución del virus adenoasociado, que es un vector ampliamente utilizado para la terapia génica. Después de abrir CryoSPARC v3 en un navegador web y crear el espacio de trabajo para el proyecto, navegue hasta el nuevo espacio de trabajo y abra el generador de trabajos en el panel derecho.
Haga clic en importar películas y proporcione la ruta de las películas y obtenga la ruta del archivo de referencia. A continuación, establezca los parámetros de adquisición. A continuación, haga clic en la cola, seleccione un carril para ejecutar el trabajo y un espacio de trabajo y haga clic en crear.
Abra la corrección de movimiento del parche y la tarjeta de trabajo de importación de películas. A continuación, arrastre la salida de imported_movies al marcador de posición de películas en el nuevo trabajo y ponga en cola el trabajo. Para realizar la función de transferencia de contraste o la estimación de CTF, abra el parche CTF estimation.
Introduzca las micrografías generadas y ponga en cola el trabajo. Para inspeccionar las micrografías promediadas y corregidas por CTF y seleccionar un subconjunto para su posterior procesamiento, abra exposiciones de curación, ingrese las exposiciones obtenidas del paso anterior y ponga en cola el trabajo. Después de que el trabajo entre en modo de espera, haga clic en la pestaña interactiva en la tarjeta de trabajo.
Ajuste los umbrales de los parámetros y acepte o rechace micrografías individuales para su posterior procesamiento. Mientras procesa los datos actuales, establezca el umbral superior de astigmatismo en 400 angstroms, la resolución de ajuste CTF en cinco angstroms y el espesor relativo del hielo en dos. Luego haga clic en listo para seleccionar las micrografías para el procesamiento posterior.
Para la recolección manual, abra el selector manual. Introduzca las exposiciones aceptadas y ponga en cola el trabajo. Luego haga clic en la pestaña interactiva, establezca el tamaño de la caja en 300 píxeles y haga clic en unos pocos cientos de partículas en múltiples micrografías, evitando la superposición de partículas.
Una vez que haya terminado con la selección, haga clic en listo recoger las partículas de extracto. A continuación, para generar plantillas para la selección automatizada de partículas, haga clic en clasificación 2D e ingrese las selecciones de partículas generadas. A continuación, cambie el número de clases 2D a 10 y ponga en cola el trabajo.
A continuación, abra las clases 2D seleccionadas e ingrese las partículas y los promedios de clase obtenidos en el paso anterior. Luego haga clic en la pestaña interactiva, seleccione clases 2D representativas con una buena relación señal-ruido y haga clic en listo. Para la selección de partículas basada en plantillas, abra el selector de plantillas e introduzca las clases y micrografías 2D seleccionadas.
A continuación, establezca el diámetro de partícula en 220 angstroms y ponga en cola el trabajo. Finalmente, abra el extracto de las micrografías e ingrese las micrografías y partículas obtenidas de la inspección de las selecciones de partículas. A continuación, establezca el tamaño de la caja extraída en 300 píxeles y ponga en cola el trabajo.
Para la clasificación 2D, haga clic en clasificación 2D e ingrese las partículas extraídas. A continuación, establezca el número de clases 2D en 50 y ponga en cola el trabajo. A continuación, abra las clases 2D seleccionadas e ingrese las partículas obtenidas y los promedios de clase.
Haga clic en la pestaña interactiva. Elija clases 2D en función de la resolución y el número de partículas en la clase y haga clic en listo. Para generar un volumen 3D inicial, abra la reconstrucción ab-initio e ingrese las partículas de la clasificación 2D final.
A continuación, ajuste la simetría a icosaédrico y ponga en cola el trabajo. A continuación, abra el refinamiento homogéneo, ingrese el volumen del paso anterior y las partículas de la clasificación 2D final. A continuación, cambie la simetría y ponga en cola el trabajo.
Cuando termine el trabajo, inspeccione la correlación de la cáscara de Fourier o la curva FSC y descargue el volumen para examinarlo en UCSF Chimera. En CryoSPARC v3, abra la tarjeta de trabajo del trabajo de clase 2D seleccionado de la clasificación 2D final. Luego, en la pestaña de detalles, haga clic en exportar trabajo.
Con PyEM, convierta el particles_exported. cs a formato estrella ejecutando el comando indicado. Después de hacer clic en la extracción de partículas, en la pestaña E/S, ingrese las micrografías y coordenadas corregidas por CTF.
Luego haga clic en la pestaña de extracción, cambie el tamaño del cuadro de partículas a 300 píxeles y ejecute el trabajo. Para el refinamiento 3D, utilice el mapa generado en CryoSPARC v3 como modelo inicial en RELION-3. Seleccione el método de importación y establezca los parámetros indicados en la ficha E/S.
Luego, en la pestaña otros, seleccione el mapa CryoSPARC v3 como archivo de entrada, cambie el tipo de nodo a referencia 3D y ejecute el trabajo. A continuación, seleccione el refinamiento automático 3D y, en la pestaña E/S, establezca las imágenes de entrada como partículas. archivo estrella del último trabajo de selección.
Utilice la reconstrucción CryoSPARC v3 como mapa de referencia, haga clic en la pestaña de referencia y cambie el filtro inicial de paso bajo a 50 angstroms y la simetría a icosaédrica. Luego, en la pestaña de optimización, cambie el diámetro de la máscara a 280 angstroms y ejecute el trabajo. Para el procesamiento posterior, haga clic en el procesamiento posterior.
Y en la pestaña E/S, ingrese los medios mapas y la máscara creados y establezca el tamaño de píxel calibrado en 1.045 angstroms. Luego, en la pestaña de nitidez, para estimar el factor B automáticamente, ingrese sí. Para obtener la resolución más baja para el ajuste automático B, ingrese 10.
Y para usar su propio factor B, ingrese no. Finalmente, en la pestaña filtro, establezca omitir la ponderación FSC en no y ejecute el trabajo. Para el entrenamiento de pulido, abra el pulido bayesiano.
Y en la pestaña E/S, ingrese las micrografías, partículas y PostProcess corregidos por movimiento. archivo estrella obtenido anteriormente. Haga clic en la pestaña de entrenamiento y establezca los parámetros óptimos del tren en sí, fracción de píxeles de Fourier para probar a 0.5 y use esta cantidad de partículas a 5, 000.
A continuación, ejecute el trabajo. Una vez finalizado el trabajo de capacitación, haga clic en Pulido bayesiano. Luego, en la pestaña de entrenamiento, establezca los parámetros óptimos del tren en no.
Seleccione la pestaña de pulido y, en el archivo de parámetros optimizados, especifique la ruta a la opt_params_all_groups. txt del paso anterior y haga clic en ejecutar. Para estimar aberraciones de orden superior, abra el refinamiento de CTF.
Y en la pestaña E/S debajo de partículas, seleccione la ruta al archivo estrella que contiene partículas pulidas del reciente trabajo 3D refinado. Luego, en el archivo STAR de posproceso, establezca la ruta a la salida del último trabajo de posprocesamiento. A continuación, seleccione la pestaña de ajuste y establezca la ampliación anisotrópica estimada en no.
Realice la ajuste del parámetro CTF a no. Estime beamtilt a sí. También estime el trébol a sí.
Y estimar las aberraciones de cuarto orden en sí. A continuación, ejecute el trabajo. Para refinar y validar aún más el mapa RELION-3, inicie Scipion 3 y cree un nuevo proyecto.
En el panel de protocolos de la izquierda, seleccione el menú desplegable de importaciones y haga clic en importar partículas. Cambie la importación de parámetros de a RELION-3 y el archivo en estrella a postprocess.star. A continuación, especifique los parámetros de adquisición como se demostró anteriormente y haga clic en ejecutar.
A continuación, haga clic en el menú desplegable de importaciones y seleccione importar volúmenes. En importar desde, proporcione la ruta al mapa RELION-3, cambie la frecuencia de muestreo del tamaño de píxel a 1,045 angstroms por píxel y ejecútelo. Para realizar una alineación global, seleccione el menú desplegable refinar en el panel de protocolos y haga clic en xmipp3-highres.
Ingrese las partículas y volúmenes importados de los pasos anteriores como imágenes de tamaño completo y volúmenes iniciales respectivamente y establezca el grupo de simetría en icosaédrico. Luego, en la pestaña de alineación de imágenes en asignación angular, elija global, establezca la resolución máxima del objetivo en tres angstroms y ejecute el trabajo. Para realizar una alineación local, seleccione xmipp3-highres global, cambie continuar de la ejecución anterior a yes y seleccione el trabajo anterior.
Luego, en la pestaña de asignación angular, cambie la alineación de la imagen a local y establezca la resolución máxima del objetivo en 2.1 angstroms. Después de terminar, en la ventana de resultados de xmipp3-highres, haga clic en los gráficos de resolución de pantalla para ver cómo ha cambiado el FSC después del refinamiento y haga clic en el histograma de gráfico con cambios angulares para ver si las asignaciones de ángulo de Euler han cambiado. Inspeccione el volumen en UCSF Chimera.
Amplíe y busque funciones de alta resolución. Se seleccionaron micrografías con buen ajuste CTF y bajo astigmatismo para su posterior procesamiento, mientras que aquellas con alto astigmatismo y pérdida se descartaron. Se seleccionaron promedios de clase 2D que contenían clases bien definidas, y se rechazaron aquellos con baja resolución, ruido y partículas parciales.
Aquí se muestran las regiones del mapa de microscopía crioelectrónica equipadas con coordenadas atómicas de un virus adenoasociado. Las densidades EM bien definidas permiten ajustar cadenas laterales de aminoácidos individuales, moléculas de agua e iones de magnesio. Las curvas FSC calculadas con CryoSPARC v3, RELION-3 y Scipion indican una resolución creciente en todo el flujo de trabajo, las estimaciones de resolución en cuatro segmentos diferentes a través de las estructuras y los histogramas de resolución demuestran la mejora incremental en la resolución local entre los mapas a lo largo del flujo de trabajo.
La combinación de algoritmos de procesamiento crio-EM de CryoSPARC, RELION-3, Scipion y Phoenix dio como resultado un aumento de la resolución de las estructuras de virus adenoasociadas de 2.9 a 2.3 angstroms en toda la tubería de procesamiento. Es importante recordar que los parámetros especificados en cada paso dependen de la muestra y del microscopio. Además, la capacidad de alcanzar una alta resolución depende en gran medida de la calidad de la muestra y de los datos en bruto.
En este video, presentamos el robusto flujo de trabajo de SP para el procesamiento de datos cryo-EM en varias plataformas de software. Mediante el uso de este enfoque, se pueden implementar algoritmos para múltiples programas para refinar y validar las estructuras criogénicas. Este flujo de trabajo se puede aplicar a los cálculos de estructura de una amplia variedad de conjuntos macromoleculares.
