وأيد هذا العمل من قبل Labex MemoLife والتي ARSEP (مؤسسة صب L&#39;مساعد à لا بحوث سور لا يتصلب أون لويحات)

1. حلول والمواد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول سفينة العزلة: B1، إضافة 1.5 مل من HEPES 1M إلى 150 مل من HBSS. B2، إضافة 3.6 غرام من ديكستران إلى 20 مل من B1. B3، إضافة 1 غرام من BSA إلى 100 مل من B1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعديل حامل المرشح عن طريق قطع الجزء السفلي من الجزء العلوي الشد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول المناعية: حل التثبيت، 4٪ لامتصاص العرق في PBS الرقم الهيدروجيني 7.4. Permeabilization / عرقلة الحل، يخفف مصل الماعز إلى 5٪ وتريتون X100 إلى 0.25٪ في PBS الرقم الهيدروجيني 7.4. ملاحظة: التثبيت يعتمد على نوع من الأجسام المضادة الأولية المستخدمة. </li></ol> 2. تشريح ملاحظة: ليس مطلوبا من ظروف معقمة، ما لم يتم استخدام السفن لأغراض زراعة الخلايا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد كوب 150 مل مع 20 مل من B1. الحفاظ على الجليد، وتغطي مع parafilm لتجنب تلوث الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عميق تخدير الماوس تحت غطاء محرك السيارة مع منشفة ورقية صغيرة غارقة في 1 مل من الأيزوفلورين النقي الذي يضاف الباحثس القفص. يتم التحقق منها التخدير بسبب عدم وجود رد فعل لقرصة أخمص قدميه. قتل الماوس عن طريق خلع عنق الرحم. ملاحظة: يتم إنجاز هذه الخطوات في الامتثال للوائح الوطنية والمؤسسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: إجراء نضح داخل القلب مع 20 مل من برنامج تلفزيوني 1x إلى القضاء على محتوى الدم 24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القسم الجلد مع مشرط من الرقبة إلى الأنف وتسحبه بعيدا. إزالة الشعر عن تلويث مع PBS 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفتح الجمجمة، أدخل لأول مرة مقص الأمامية إلى البصلة الشمية، وفتح المقص لتمزق في الجمجمة في جزأين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية الدماغ باستخدام ملعقة الدماغ. تشريح خارج الضفيرة المشيمية من البطينات الجانبية لأنها تلوث الأوعية الدموية إعداد 38. ملاحظة: اختياري: سوف يحتوي على الإعداد النهائي متني والسحايا السفن. إن لم يكن المطلوب، السحايا يمكن خلع باتباع الإجراء التي وصفها 38. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TRansfer الدماغ في دورق يحتوي على حل B1 على الجليد. ما يصل إلى 8 أدمغة يمكن معالجتها معا. </li></ol> 3. الدماغ الأنسجة التجانس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام اثنين من المشارط، يدويا وبقوة للفوز على الدماغ في حل B1 الحصول بعد ذلك قطع صغيرة من حوالي 2 مم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التجانس إعداد مع Dounce الخالط المؤتمتة، وأداء 20 السكتات الدماغية في 400 دورة في الدقيقة. تأكد من أن أنبوب زجاجي يتم الاحتفاظ في الجليد وأن الجزء العلوي من douncer في حل عندما تتحرك صعودا وهبوطا، وذلك لمنع تشكيل جيوب الهواء. إذا كنت على استعداد عدة عينات، وغسل douncer مع الماء المؤين بين كل التجانس. </li></ol> 4. السفينة تنقية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل جناسة في أنبوب من البلاستيك 50 مل، والشروع في الطرد المركزي في 2000 ز لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. وهناك واجهة بيضاء كبيرة (ومعظمهم من المايلين) تتشكل على الجزء العلوي من بيليه السفينة (أحمر إذا تم إجراء أي نضح). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف. بيليه السفينة واجهة بيضاء ستظل المرفقة معا. إضافة 20 مل من محلول B2 المثلج ويهز الأنبوب يدويا وبقوة لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى الطرد المركزي الثاني في 4400 ز لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. فإن المايلين الآن تشكل طبقة بيضاء كثيفة على سطح طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل بعناية طبقة المايلين من جدران أنبوب من خلال عقد أنبوب وتناوب على السماح طاف لتمرير على طول الجدران ببطء. تجاهل المايلين مع طاف. بيليه الذي يحتوي على السفن لا تزال تعلق في الجزء السفلي من الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار على الجدار الداخلي للأنبوب مع ورقة ماصة ملفوفة حول البلاستيك 5 مل ماصة وإزالة جميع السوائل المتبقية، وتجنب لمس بيليه السفينة. الحفاظ على أنبوب رأسا على عقب على ورقة ماصة لاستنزاف أي السائل المتبقي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق بيليه في 1 مل من محلول B3 المثلج قبل pipetting صعودا وهبوطا مع نصائح الاسعار المنخفضة للملزم، keepiنانوغرام أنبوب على الجليد، ثم يضاف 5 مل من محلول آخر B3. تأكد من أن السفن تنتشر بقدر الإمكان ولا تشكل الحصى. </li></ol> 5. الترشيح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد كوب على الجليد مع 30 مل من محلول B3 الجليد الباردة. تغطية مع parafilm لتجنب تلوث الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مرشح 20 ميكرون شبكة على حامل المرشح تعديل على الجزء العلوي من قارورة بيكر وتتوازن من خلال تطبيق 10 مل من محلول B3 الجليد الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب إعداد السفينة على مرشح وشطف السفن مع 40 مل من محلول B3 الجليد الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرداد تصفية باستخدام ملقط نظيفة وتزج فورا في دورق يحتوي الحل B3. فصل الأوعية من مرشح عن طريق هز بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب محتويات الكأس في 50 مل أنبوب من البلاستيك وأجهزة الطرد المركزي في 2000 ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملاحظة: بدلا من ذلك، تعليق الأوعية الدماغ من الخطوة 4.6 يمكن أن تتم تصفيته على 100 مرشح ميكرون شبكة.في هذه الحالة، يتم الاحتفاظ السفن الكبيرة تفضيلي على مرشح في حين أن التدفق من خلال يتضمن microvessels (الشعيرات الدموية في المقام الأول)، والتي ثم يصفى على فلتر 20 ميكرون شبكة على النحو الوارد أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية من microvessels في 1 مل من محلول B3 المثلج وتحويلها من قبل pipetting قبل ان تتحول الى 1.5 مل إيبندورف أنبوب. الطرد المركزي في 2000 ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. </li></ol> 6. التثبيت، ومنع Permeabilization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سفن نقل من قبل pipetting إلى 0.2 مل أنابيب PCR يحتوي PBS باستخدام 1.0 مل منخفضة طرف ملزم. يجب الحرص على عدم لمس السفن لأنها قد تنضم إلى الجزء الخارجي من الحافة. تنفيذ كافة الخطوات التالية تحت المجهر مجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل من التغييرات متوسطة التالية، وترك الأنابيب على الجليد حتى وصلت سفن القاع، وماصة للخروج معظم السوائل باستخدام طويلة والشيء هلام تحميل نصائح الماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أكثر من برنامج تلفزيوني وإضافة 200 ميكرولتر من محلول تثبيتي.تعليق السفن عن طريق هز بلطف واحتضان لمدة 20 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة من الحل تثبيتي، واستبدالها مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X (غسل الأولى)، واحتضان لمدة 5 دقائق على RT وكرر هذه الخطوة 3 مرات. في كل مرة، تحقق من أن السفن قد غرقت بشكل صحيح إلى الجزء السفلي من الأنابيب وماصة من برنامج تلفزيوني 1X، ضمان عدم لمس السفن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل الماضي، استبدال برنامج تلفزيوني 1X من قبل permeabilization / حل الحجب واحتضان 1 ساعة عند RT، إعادة التعليق على السفن عن طريق هز بلطف من وقت لآخر. </li></ol> 7. المناعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال permeabilization / عرقلة الحل مع مزيج من الأجسام المضادة الأولية (انظر المراجع من الأجسام المضادة المستخدمة هنا والتخفيفات في مواد الجدول قالب) المخفف في permeabilization / حل حظر، واحتضان عند 4 درجات CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 3 يغسل في برنامج تلفزيوني في RT، واحتضان السفن مع مزيج من الأجسام المضادة الثانوية المخفف في برنامج تلفزيوني لمدة 2 ساعةفي RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملاحظة: نحن نوصي بشدة أداء تلطيخ النووي مع هويشت (1: 2000) أو دابي (1: 2000) لتمييز السفن من الممكن تلويث الشعر أو الغبار تحت المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 3 يغسل في برنامج تلفزيوني، resuspend والسفن في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. </li></ol> 8. تركيب ومراقبة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد طرف مع الزجاج الشعرية siliconized و: قطع رأس P200 ماصة باستخدام مشرط وضبط الشعرية في الداخل. حجم تقريبي من شعري 40 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل السفن على شريحة زجاجية باستخدام الزجاج الشعرية siliconized و، وإزالة بعناية السائل مع قطعة من ورق ماص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق قطرة واحدة من تصاعد المتوسطة على السفن وعقد ساترة في 45º السماح للإسقاط لتنتشر على طول حافة الانزلاق. ترك قبالة ساترة والسماح المتوسطة تنتشر ببطء. السماح لها الجافة O / N في RT مع الحماية من الضوء. ويمكن ملاحظة السفن تحت fluorescالأنف والحنجرة المجهر متحد البؤر. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

حاجز الدم في الدماغ وينظم مرور المواد الفسيولوجية داخل وخارج الجهاز العصبي المركزي، ويحمي ضد المواد الضارة المحتملة الحالية في الدم. وتشارك في العديد من الأمراض CNS، بما في ذلك أمراض الاعصاب 2 وأورام الدماغ 28. نفاذية منخفضة للغاية من BBB أيضا يعيق مرور العوا...

يتطلب الأداء السليم للنظام العصبي المركزي (CNS) بيئة خارج الخلية درجة عالية من التنظيم، ومطالبها التمثيل الغذائي ضخمة مقارنة مع الأجهزة الأخرى 1. الجهاز العصبي المركزي هي أيضا حساسة للغاية لمجموعة واسعة من المواد الكيميائية، وغير مؤذية عادة إلى الأجهزة الطرفية ولكن إلى ذلك، أعصاب. لضمان الأداء السليم، أكثر من &quot;CNS الأوعية الدموية تشكل عائقا البطانية. حاجز الدم في الدماغ (BBB) ​​التي تسيطر على تدفق الجزيئات والأيونات وكذلك مرور الخلايا المناعية بين الدم والدماغ، وبالتالي المحافظة على التوازن السليم 2، ولكن أيضا تحد من دخول الأدوية العلاجية، والعلاج مما يعوق الاضطرابات العصبية 3. على المستوى الخلوي، وحافظ على BBB أساسا من منعطفات ضيقة واسعة بين الخلايا البطانية والتعبير استقطابا للنقل هروب رأس المال ومعدل transcytosis منخفضة جدا (4). خصائص ووظائف BBB وبفعل معظمهم من شمال شرقخلايا ighboring 4. على وجه الخصوص، pericytes تلعب دورا هاما في تحريض والحفاظ على BBB 5،6. كونها خلايا مقلص، pericytes أيضا تنظيم تدفق الدم 7 كما تفعل خلايا العضلات الملساء المحيطة السفن الكبيرة. وأخيرا، النجمية، فإن الخلايا الدبقية الرئيسية في الدماغ، وترسل العمليات الكبيرة اسمه endfeet حول معظم الأوعية الدموية في الدماغ 8 و تعدل BBB النزاهة والهدوء المناعي 9، ونقل نواتج الأيض في الخلايا العصبية 10، ولحث على اقتران ضيق بين نشاط الخلايا العصبية و تدفق الدم 11،12. القدرة على دراسة الخصائص الجزيئية والخلوية للنظام الدماغية هي حاسمة لتوصيف أفضل مساهمته في علم وظائف الأعضاء والدماغ الفيزيوباثيا. لمعالجة هذه المسألة، وقد وضعت استراتيجيات لعزل نظام الدماغية في المخ، والتي تسمح لإعداد سليمة شظايا سفينة الدماغ. الدماغي السفينة صوقد وصفت urification في البداية باستخدام العقول البقري 13 وتحسنت وتتكيف مع الأنواع الأخرى، وخاصة القوارض 14. في هذه الدراسة الأخيرة، تم إدخال استخدام مرشحات من أحجام مختلفة لفصل الأوعية الدماغية في لكسور التخصيب في السفن من أقطار مختلفة. ومن المثير للاهتمام، في مثل هذه الاستعدادات، تبقى الخلايا البطانية خصائص الأيض الخاصة 15، وظائف نقل 16 والاستقطاب 17. هنا، نحن تصف بالتفصيل هذا البروتوكول، وكذلك إثبات أن السفن معزولة تحتفظ معظم من هم في الهياكل الموقع. الخلايا البطانية تبقى مرتبطة من قبل منعطفات ضيقة ومحاطة الصفيحة القاعدية مستمرة. Pericytes وخلايا العضلات الملساء لا تزال تعلق على طبقة الخلايا البطانية، وكذلك الأغشية المحيطة بالأوعية نجمية. ومع ذلك، يتم استبعاد الخلايا النجمية، الخلايا الدبقية، الخلايا العصبية و oligodendrocytes. وأخيرا، نحن تصف الإجراء لأداء المناعية على السفن الدماغ معزولة. </P&gt; حتى الآن وقد أجريت معظم الدراسات الجزيئية والخلوية المتعلقة بنظام الدماغية على تنقية خلايا الدماغ سفينة فصلها باستخدام سلالات مراسل الماوس محددة الخلية أو الإجراءات القائمة على المناعية 18،19 الفرز الخلية. على الرغم من أن هذه التقنيات تتيح للعزلة من الذهب الخالص تقريبا السكان الخلية الدماغية، الخلايا المعزولة يفقد تماما في الموقع التشكل والتفاعل، وهذا بدوره يؤثر بشكل كبير ممتلكاتهم الجزيئية والخلوية. وصف بروتوكول هنا، مما يسمح لعزل شظايا الدماغية بأكملها دون الحاجة للأجسام معينة أو بقع الماوس المعدلة وراثيا، ويقدم بديلا جيدا كما في الهيكل العام للالأوعية الدماغية المعزولة يتم حفظها، وبالتالي تقليل تداعيات على ممتلكاتهم الجزيئية. ويمكن بعد ذلك أن تستخدم سفن معزولة لدراسة النشاط الجيني، تخليق البروتين والتنظيم على BBB كما هو موضح في الآونة الأخيرة 20،21 </suP&gt;. وأخيرا، بالمقارنة مع الليزر التقاط تسليخ مجهري 22،23 هذا البروتوكول غير مكلفة وسهلة لأداء وقدرة على التكيف بسرعة إلى أي مختبر.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue Grinder Size C</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>3431E25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge 5415&#160;R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811000320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance, Modular Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact System Provides High Quality Leica LED1000</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LED1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low binding tips (P1000)</td>
			<td>Sorenson BioScience</td>
			<td>14200T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex 47mm filter holder PP 8/Pk</td>
			<td>Millipore</td>
			<td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=SX0004700">SX0004700</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon net filter disc Hydrophilic 20&#181;m 47mm 100/Pk</td>
			<td>Millipore</td>
			<td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY2004700">NY2004700</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon net filter disc Hydrophilic 100&#181;m 47mm 100/Pk</td>
			<td>Millipore</td>
			<td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY1H04700">NY1H04700</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Wall Borosilicate Tubing</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>B150-86-7.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1014356290F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips, Thickness 1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P10143263NR1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,2 ml Thin-walled tubes and domed cap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;PARAFILM&#174; M (roll size 4 in. &#215; 125 ft)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Life technology</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14175129">14175-129</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>ET330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor&#174; 488 Conjugate; Dilution 1/100</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>I21411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrin (rabbit) ; dilution 1/400</td>
			<td colspan="2">kindly provided by Dr Markus A Ruegg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12)</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>33-9100</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti GFAP (mouse, clone GA5)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3893</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti AQP4 (rabbit)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5971</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Cx43 (mouse, Clone&#160; 2)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610061</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Olig2 (rabbit)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB9610</td>
			<td>&#160;dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti NF-M (mouse)</td>
			<td colspan="2">provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland.</td>
			<td>&#160;dilution 1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Iba1 (rabbit)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td>&#160;dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#174; 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A11029</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 488 conjugate</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A11034</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#174; 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A21424</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 555 conjugate</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A21429</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of mouse brain vessels

في الدماغ، أكثر من نظام الأوعية الدموية تتكون من حاجز انتقائي، حاجز الدم في الدماغ (BBB) ​​الذي ينظم تبادل الجزيئات والخلايا المناعية بين الدماغ والدم. وعلاوة على ذلك، يتطلب الطلب الهائل التمثيل الغذائي الخلايا العصبية لائحة لحظة إلى لحظة تدفق الدم. والجدير بالذكر أن شذوذ هذه الأنظمة هي السمات المميزة المسببة لمعظم أمراض الدماغ. بما في ذلك الإصابة بالورم الأرومي الدبقي، والسكتة الدماغية، وذمة، والصرع، والأمراض التنكسية (مثلا: مرض باركنسون ومرض الزهايمر)، وأورام الدماغ، وكذلك حالات الالتهابات مثل التصلب المتعدد، والتهاب السحايا والدماغ الخلل الناجم عن الإنتان. وبالتالي، فهم الأحداث يشير إلى تحوير علم وظائف الأعضاء الدماغية يمثل تحديا كبيرا. الكثير من التبصر في خصائص الخلوية والجزيئية من مختلف أنواع الخلايا التي يتكون منها نظام الدماغية يمكن الحصول عليها من الثقافة الأساسية أو الخلية الفرز من أنسجة المخ فصلها حديثا. ومع ذلك،لا يتم الاحتفاظ بخصائص مثل الخلية القطبية، مورفولوجيا والعلاقات بين الخلايا في هذه الاستعدادات. تم تصميم البروتوكول الذي وصفنا هنا لتنقية شظايا سفينة الدماغ، مع الحفاظ على السلامة الهيكلية. وتبين لنا أن السفن معزولة تتكون من الخلايا البطانية مختومة من قبل منعطفات ضيقة التي تحيط بها الصفيحة القاعدية مستمرة. Pericytes، خلايا العضلات الملساء وكذلك الأغشية المحيطة بالأوعية نجمية endfeet لا تزال تعلق على طبقة الخلايا البطانية. وأخيرا، نحن تصف كيفية إجراء التجارب المناعية على السفن الدماغ تنقيته.

هنا، نحن تصف بروتوكول يسمح للعزلة الميكانيكية للسفن الدماغ 14 الشكل 1 يلخص الخطوات الرئيسية لهذه التقنية. عمارة السفن الدماغ معقدة وتتضمن عدة أنواع الخلايا، أي الخلايا البطانية مختومة من قبل منعطفات ضيقة ومحاطة pericytes، وخلايا العضلات الملساء، وال?...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Mouse Brain Vessels at JoVE.com

Purification of Mouse Brain Vessels

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

تنقية ماوس سفن الدماغ

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.1K Views.  Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale. We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes. 

Video: Purification of Mouse Brain Vessels

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

إعداد أنسجة المخ فأرة للالميكروسكوب Immunoelectron

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

متعددة الماوس تشريحي عصبي التصوير بالرنين المغناطيسي

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Multiphoton المجهر من مخ الفأر مسح تعرب عن YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

كله جبل التصوير من جنين فأر التوقعات الحسية أكسون

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

تصوير ثلاثي الأبعاد على نطاق واسع من المنظمة الخلوية في اللحاء الجديد الماوس

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), including gene therapy applications. AAV vectors are non-replicating, able to infect both dividing and non-dividing cells&#160;and provide long-term transgene expression. Importantly, some serotypes, such as the newly described PHP.B, can cross the blood-brain-barrier (BBB) in animal models, following systemic delivery. AAV vectors can be efficiently produced in the laboratory. However, robust and reproducible protocols are required to obtain AAV vectors with sufficient purity levels and titer values high enough for in vivo applications. This protocol describes an efficient and reproducible strategy for AAV vector production, based on an iodixanol gradient purification strategy. The iodixanol purification method is suitable for obtaining batches of high-titer AAV vectors of high purity, when compared to other purification methods. Furthermore, the protocol is generally faster than other methods currently described. In addition, a quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based strategy is described for a fast and accurate determination of the vector titer, as well as a silver staining method to determine the purity of the vector batch. Finally, representative results of gene delivery to the CNS, following systemic administration of AAV-PHP.B, are presented. Such results should be possible in all labs using the protocols described in this article.

Here, we describe an efficient and reproducible strategy to produce, titer, and quality-control batches of adeno-associated virus vectors. It allows the user to obtain a vector preparation with high-titer&#160;(&#8805;1 x 1013 vector genomes/mL) and a high purity, ready for in vitro or in vivo use.

إنتاج وتنقية ومراقبة الجودة لناقلات القائم على الفيروسات المرتبطة بالغدة

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the dendritic filopodia establish contact with a target axon, they begin maturing into spines, leading to the formation of a synapse. Telencephalin (TLCN) is abundantly localized in dendritic filopodia and is gradually excluded from spines. Overexpression of TLCN in cultured hippocampal neurons induces dendritic filopodia formation. We showed that telencephalin strongly binds to an extracellular matrix molecule, vitronectin. Vitronectin-coated microbeads induced phagocytic cup formation on neuronal dendrites. In the phagocytic cup, TLCN, TLCN-binding proteins such as phosphorylated Ezrin/Radixin/Moesin (phospho-ERM), and F-actin are accumulated, which suggests that components of the phagocytic cup are similar to those of dendritic filopodia. Thus, we developed a method for purifying the phagocytic cup instead of dendritic filopodia. Magnetic polystyrene beads were coated with vitronectin, which is abundantly present in the culture medium of hippocampal neurons and which induces phagocytic cup formation on neuronal dendrites. After 24 h of incubation, the phagocytic cups were mildly solubilized with detergent and collected using a magnet separator. After washing the beads, the binding proteins were eluted and analyzed by silver staining and Western blotting. In the binding fraction, TLCN and actin were abundantly present. In addition, many proteins identified from the fraction were localized to the dendritic filopodia; thus, we named the binding fraction as the dendritic filopodia-rich fraction. This article describes details regarding the purification method for the dendritic filopodia-rich fraction.

In this protocol, we introduce a method for purifying the dendritic filopodia-rich fraction from the phagocytic cup-like protrusion structure on cultured hippocampal neurons by taking advantage of the specific and strong affinity between a dendritic filopodial adhesion molecule, TLCN, and an extracellular matrix molecule, vitronectin.

تنقية الكسر الدندي الغنية فيلبوديا

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, and a ventricular zone niche, which generates the inhibitory GABAergic Purkinje cells, which are neurons that constitute the deep cerebellar nuclei and Bergman glia. Recently, a third stem cell niche has been described that arises as a secondary germinal zone from the ventricular zone niche. The cells of this niche are defined by the cell surface marker prominin-1 and are localized to the developing white matter of the postnatal cerebellum. This niche accounts for the late born molecular layer GABAergic interneurons along with postnatally generated cerebellar astrocytes. In addition to their developmental role, this niche is gaining translational importance in regards to its involvement in neurodegeneration and tumorigenesis. The biology of these cells has been difficult to decipher because of a lack of efficient techniques for their purification. Demonstrated here are efficient methods to purify, culture, and differentiate these postnatal cerebellar stem cells.

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Demonstrated here is an efficient and cost-effective method to purify, culture, and differentiate white matter stem cells from postnatal mouse cerebellum.

تنقية Prominin-1+ الخلايا الجذعية من المخيخ الماوس بعد الولادة

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell resolution using electrophysiology, microscopy, and pharmacology. However, a major consideration in the design of in vitro experiments is the extent to which different slice preparations recapitulate naturalistic patterns of neural activity as observed in vivo. In the intact brain, the hippocampal network generates highly synchronized population activity reflective of the behavioral state of the animal, as exemplified by the sharp-wave ripple complexes (SWRs) that occur during waking consummatory states or non-REM sleep. SWRs and other forms of network activity can emerge spontaneously in isolated hippocampal slices under appropriate conditions. In order to apply the powerful brain slice toolkit to the investigation of hippocampal network activity, it is necessary to utilize an approach that optimizes tissue health and the preservation of functional connectivity within the hippocampal network. Mice are transcardially perfused with cold sucrose-based artificial cerebrospinal fluid. Horizontal slices containing the hippocampus are cut at a thickness of 450 &#956;m to preserve synaptic connectivity. Slices recover in an interface-style chamber and are transferred to a submerged chamber for recordings. The recording chamber is designed for dual surface superfusion of artificial cerebrospinal fluid at a high flow rate to improve oxygenation of the slice. This protocol yields healthy tissue suitable for the investigation of complex and spontaneous network activity in vitro.

This protocol describes the preparation of horizontal hippocampal-entorhinal cortex (HEC) slices from mice exhibiting spontaneous sharp-wave ripple activity. Slices are incubated in a simplified interface holding chamber and recordings are performed under submerged conditions with fast-flowing artificial cerebrospinal fluid to promote tissue oxygenation and the spontaneous emergence of network-level activity.

حاد الدماغ الماوس تشريح للتحقيق عفوية نشاط شبكة فرس النهر

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

شرائح فرس النهر الأفقية من دماغ الفأر

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...