Этот протокол предоставляет важный инструмент для изучения взаимодействия между иммунными клетками кишечника и эпителием и для анализа того, как эти взаимодействия могут регулироваться при кишечном гомеостазе и воспалении. Основным преимуществом этой методики является изысканный объем экспериментального контроля, облегчаемый моделью редукции in vitro, которая может быть использована для решения вопросов эпителиальной и иммунной биологии. Эта система уже использовалась для определения роли ILC1 в расширении CD44-положительных эпителиальных крипт и имеет потенциал для дальнейшего продвижения нашего понимания опосредованных воспалением желудочно-кишечных заболеваний.
Для начала поместите тепловой сшивающий базальный внеклеточный матрикс на лед, чтобы оттаять и предварительно нагреть стандартную тканевую обработанную культурой 24-луночную пластину, поместив ее в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия. После этого извлеките пластину, содержащую органоиды, из инкубатора и выбросьте среду из колодца для прохождения. Затем добавьте в скважины 500 микролитров холодного холодного DMEM F12 и, используя наконечник P-1000, извлеките органоиды из всех скважин в 15-миллилитровую трубку.
Промойте дно скважин 250-300 микролитрами холодного холодного DMEM F12, гарантируя, что в скважине не останется органоидов, и поместите в 15-миллилитровую трубку, содержащую извлеченные органоиды. Повторное суспендирование одно-двухдневной извлеченной органоидной гранулы в одном миллилитре ледяного холодного усовершенствованного DMEM F12. Предварительно покрыв одну 1,5-миллилитровую трубку PBS2 на врожденные лимфоидные клетки реплицируют образец, а затем, используя предварительно покрытый наконечник PBS2, распределяют примерно от 100 до 200 органоидов в трубку.
Используя наконечник P-1000 с покрытием PBS2, добавьте объем не менее 500 ILC1s, рассчитанный на этапе сортировки, в 1,5-миллилитровую трубку с покрытием PBS2, содержащую органоиды. Вращайте ILC1 и органоиды при 300 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и избегайте настольных центрифуг малого диаметра, так как они будут тянуть ячейки вдоль края внутренней части трубки, а не создавать гранулу на кончике трубки. Затем медленно и осторожно удалите супернатант, не нарушая гранулу, и поместите образец на лед.
Удерживая трубку на холодной поверхности, повторно суспендируют органоиды и ILC в 30 микролитрах термосшивающего базального внеклеточного матрикса не менее 10-15 раз, чтобы обеспечить равномерное распределение. Нанесите 30 микролитров на лунку органоидов ILC в термосшивающем базальном внеклеточном матриксе на предварительно нагретую 24- или 48-луночную пластину, чтобы сформировать единый купол. После этого поместите пластину непосредственно в инкубатор на 10-20 минут при температуре 37 градусов цельсия и 5% углекислого газа.
Затем добавьте 550 микролитров полной среды ILC1 на лунку с любыми желаемыми экспериментальными цитокинами или блокирующими антителами и инкубируйте при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 24 часов. Через 24 часа аккуратно извлеките пластину из инкубатора и дайте пластине посидеть в тканевом культуральном капюшоне в течение одной минуты, чтобы убедиться, что лимфоциты оседают. Удалите от 200 до 250 микролитров среды и поместите ее в пустой колодец из 24-луночной пластины.
Используя инвертированный микроскоп, проверьте супернатант, чтобы убедиться, что лимфоциты не были удалены. Если супернатант прозрачный, добавьте 300 микролитров свежей среды ILC1 к совместной культуре в исходной лунке. Если в супернатанте присутствуют лимфоциты, центрифугируют при 300-400 г в течение трех-пяти минут при четырех градусах Цельсия и повторно суспендируют гранулу в 300 микролитрах свежей среды ILC1.
Затем добавляют клеточную суспензию к оставшимся 200-250 микролитрам среды в исходной лунке. Выполнение последующего анализа с использованием иммунофлуоресценции, проточной цитометрии или очистки FACS целевых популяций в буфер лизиса для анализа экспрессии генов с помощью одноклеточного или объемного РНК-поиска или RT-qPCR, как описано в тексте. После успешного завершения прохождения здоровые и крепкие органоидные культуры показали, что свежеизолированные крипты должны образовывать почковые структуры крипт в течение двух-четырех дней.
Проточный цитометрический анализ был выполнен для выделения ILC1 тонкой кишки из трансгенной репортерной линии ROR gamma-T мышей, и было обнаружено, что ожидаемый диапазон количества ILC составляет от 350 до 3 500 изолированных клеток. После посева органоидами кокультуры могут быть визуализированы с помощью иммунохимической цитохимии. Конфокальная микроскопия выявила изображения тонкокишечных органоидов, которые культивируются отдельно и в присутствии ILC1s.
Иммуноцитохимическое окрашивание выявляет наличие CD45-положительного ILC1 в непосредственной близости от белково-1-положительных эпителиальных клеток Zonula occludens в органоидных кокультурах ILC1. Проточная цитометрия показала, что молекула клеточной адгезии эпителия маркирует эпителиальные клетки кишечника в органоидах, в то время как CD45 маркирует ILC1s. Проточный цитометрический график и иммунохимия выявили повышенную экспрессию CD44 в эпителиальных клетках кишечника при совместной культивации с ILC1.
Исследования RT-qPCR показывают, что кокультура ILC1 специфически повышала регуляцию CD44 варианта 6, который ингибировался TGF-бета-1, 2, 3 нейтрализующим антителом и регулировался рекомбинантным TGF-бета-1 в культурах только тонких кишечных органоидов. Важно быть щадящим во время манипуляций с органоидами, чтобы обеспечить поддержание целых структур и проверить, что структуры достаточно гранулировались после центрифугирования. Увеличивая сложность системы путем добавления других иммунных и неиммунных компонентов, эта система in vitro может быть использована для решения дальнейших вопросов в биологии кишечника.
