Este protocolo proporciona una herramienta significativa para estudiar las interacciones entre las células inmunes intestinales y el epitelio y para diseccionar cómo estas interacciones pueden regular la homeostasis intestinal y la inflamación. La principal ventaja de esta técnica es la exquisita cantidad de control experimental facilitado por el modelo de reducción in vitro, que se puede utilizar para abordar preguntas en biología epitelial e inmune. Este sistema ya se ha utilizado para determinar el papel de ILC1 en la expansión de las criptas epiteliales CD44 positivas y tiene el potencial de avanzar aún más en nuestra comprensión de las enfermedades gastrointestinales mediadas por la inflamación.
Para comenzar, coloque la matriz extracelular basal de reticulación térmica en el hielo para descongelar y precalentar una placa de 24 pocillos tratada con cultivo de tejidos estándar colocándola en una incubadora de 37 grados Centígrados. Después, retire la placa que contiene organoides de la incubadora y deseche los medios del pozo para pasar. Luego, agregue 500 microlitros de DMEM F12 avanzado helado a los pozos, y usando una punta P-1000, extraiga los organoides de todos los pozos en un tubo de 15 mililitros.
Enjuague el fondo de los pozos con 250 a 300 microlitros de DMEM F12 avanzado helado, asegurándose de que no queden organoides en el pozo y acumule en el tubo de 15 mililitros que contiene organoides extraídos. Resusped el pellet organoide cosechado de uno a dos días de antigüedad en un mililitro de DMEM F12 avanzado helado. Pre-recubrir un tubo de 1.5 mililitros con PBS2 por muestra de replicación de células linfoides innatas, y luego usando una punta PBS2 pre-recubierta, distribuir aproximadamente 100 a 200 organoides en el tubo.
Usando una punta P-1000 recubierta de PBS2, agregue un volumen de no menos de 500 ILC1 calculado a partir del paso de clasificación al tubo de 1.5 mililitros recubierto de PBS2 que contiene los organoides. Gire hacia abajo ILC1 y organoides a 300 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius y asegúrese de evitar las centrífugas de mesa de diámetro pequeño, ya que tirarán de las células a lo largo del borde del interior del tubo en lugar de crear un gránulo en la punta del tubo. Luego, retire el sobrenadante lenta y suavemente sin molestar el gránulo y coloque la muestra sobre hielo.
Mientras mantiene el tubo en una superficie fría, resusponga los organoides y la ILC en 30 microlitros de matriz extracelular basal de reticulación térmica al menos de 10 a 15 veces para garantizar una distribución uniforme. Aplique 30 microlitros por pocillo de organoides ILC en la matriz extracelular basal de reticulación térmica a una placa precalentada de 24 o 48 pocillos para formar una sola cúpula. Después, coloque la placa directamente en la incubadora durante 10 a 20 minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Luego, agregue 550 microlitros de medio ILC1 completo por pozo con cualquier citoquina experimental deseada o anticuerpos bloqueadores e incube a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Después de 24 horas, retire suavemente la placa de la incubadora y deje que la placa se asiente en una campana de cultivo de tejidos durante un minuto para asegurarse de que los linfocitos estén asentados. Retire de 200 a 250 microlitros de medios y colóquelos en un pozo vacío de una placa de 24 pocillos.
Usando un microscopio invertido, revise el sobrenadante para asegurarse de que no se extirpó ningún linfocitos. Si el sobrenadante es claro, agregue 300 microlitros de medio ILC1 fresco al cocultivo en el pozo original. Si los linfocitos están presentes en el sobrenadante, centrífuga a 300 a 400 G durante tres a cinco minutos a cuatro grados centígrados y resuspenda el pellet en 300 microlitros de medio ILC1 fresco.
Luego, agregue la suspensión celular a los 200 a 250 microlitros restantes de medios en el pozo original. Realice análisis aguas abajo utilizando inmunofluorescencia, citometría de flujo o purificación FACS de poblaciones objetivo en tampón de lisis para el análisis de expresión génica mediante una búsqueda de ARN de una sola célula o a granel o RT-qPCR como se describe en el texto. Después de completar con éxito el paso, los cultivos de organoides sanos y robustos revelaron que las criptas recién aisladas deberían formar estructuras de cripta en ciernes dentro de dos a cuatro días.
El análisis citométrico de flujo se realizó para aislar la ILC1 del intestino delgado de la línea reportera transgénica murina ROR gamma-T, y se encontró que el rango de recuento esperado de ILC era de 350 a 3, 500 células aisladas. Después de ser sembrados con organoides, los cocultivos pueden ser visualizados por citoquímica inmunoquímica. La microscopía confocal reveló las imágenes de organoides del intestino delgado que se cultivan solos y en presencia de ILC1s.
La tinción inmunocitoquímica revela la presencia de ILC1 CD45 positivo en las proximidades de las células epiteliales positivas para la proteína 1 de Zonula occludenss en cocultivos organoides de ILC1. La citometría de flujo demostró que la molécula de adhesión celular epitelial marca las células epiteliales intestinales en los organoides, mientras que CD45 marca las ILC1. La gráfica citométrica de flujo y la inmunoquímica revelaron un aumento de la expresión de CD44 en las células epiteliales intestinales cuando se cocultivaron con ILC1.
Los estudios rt-qPCR muestran que el cocultivo ILC1 específicamente reguló al alza la variante 6 de CD44, que fue inhibida por el anticuerpo neutralizante TGF-beta 1, 2, 3 y regulada al alza por TGF-beta 1 recombinante en cultivos solo de organoides del intestino delgado. Es importante ser suave durante la manipulación de los organoides para garantizar que todas las estructuras se mantengan y para comprobar que las estructuras se han peletizado lo suficiente después de la centrifugación. Al aumentar la complejidad del sistema mediante la adición de otros componentes inmunes y no inmunes, este sistema in vitro se puede utilizar para abordar otras preguntas en la biología intestinal.
