このプロトコルは、腸の免疫細胞と上皮の間の相互作用を研究し、これらの相互作用が腸の恒常性と炎症をどのように調節するかを解剖するための重要なツールを提供します。この技術の主な利点は、インビトロモデルの減少によって促進される絶妙な量の実験制御であり、これは上皮および免疫生物学における疑問に対処するために使用することができる。このシステムは、CD44陽性上皮陰窩の拡大におけるILC1の役割を決定するためにすでに使用されており、炎症媒介性胃腸疾患の理解をさらに進歩させる可能性を秘めている。
まず、熱架橋基底細胞外マトリックスを氷の上に置き、標準組織培養処理した24ウェルプレートを37°Cのインキュベーターに入れて解凍し、予め温めます。その後、オルガノイドを含むプレートをインキュベーターから取り出し、継代するウェルから培地を捨てる。次に、500マイクロリットルの氷冷高度DMEM F12をウェルに加え、P-1000チップを使用して、すべてのウェルからオルガノイドを15ミリリットルのチューブに収穫する。
ウェルの底を250~300マイクロリットルの氷冷アドバンスドDMEM F12ですすいで、ウェルにオルガノイドが残っていないことを確認し、収穫したオルガノイドを含む15ミリリットルのチューブにプールします。1〜2日齢の収穫したオルガノイドペレットを1ミリリットルの氷冷高度DMEM F12に再懸濁する。先天性リンパ球細胞複製試料につき1本のPBS2で1本の1.5ミリリットルチューブをプレコートし、次いでプレコートPBS2チップを用いて、約100〜200個のオルガノイドをチューブ内に分配する。
PBS2コーティングP-1000チップを使用して、オルガノイドを含むPBS2コーティング1.5ミリリットルチューブに、選別ステップから計算された500以上のILC1sの容量を加える。ILC1とオルガノイドを300Gで摂氏4度で5分間スピンダウンし、チューブの先端にペレットを作成するのではなく、チューブ内部の端に沿って細胞を引っ張るので、小径の卓上遠心分離機を避けるようにしてください。その後、ペレットを乱すことなくゆっくりと穏やかに上清を取り除き、サンプルを氷の上に置きます。
チューブを冷たい表面に保持しながら、オルガノイドおよびILCを30マイクロリットルの熱架橋基礎細胞外マトリックス中に少なくとも10〜15回再懸濁して、均一な分布を確保する。熱架橋基底細胞外マトリックス中のILCオルガノイドを1ウェルあたり30マイクロリットルを予め加温した24ウェルまたは48ウェルプレートに塗布し、単一のドームを形成する。その後、プレートをインキュベーターに直接入れ、摂氏37度と二酸化炭素5%で10〜20分間置きます。
次いで、1ウェルあたり550マイクロリットルの完全ILC1培地を任意の所望の実験サイトカインまたはブロッキング抗体と共に加え、摂氏37度および5%二酸化炭素で24時間インキュベートする。24時間後、プレートをインキュベーターから静かに取り出し、プレートを組織培養フードに1分間座らせて、リンパ球が沈降することを確認する。200 ~ 250 マイクロリットルの培地を取り出し、24 ウェル プレートの空のウェルに入れます。
倒立顕微鏡を用いて、リンパ球が除去されていないことを確認するために上清をチェックする。上清が透明であれば、元のウェルの共培養物に300マイクロリットルの新鮮なILC1培地を加える。上清中にリンパ球が存在する場合は、300〜400Gで摂氏4度で3〜5分間遠心分離し、ペレットを300マイクロリットルの新鮮なILC1培地に再懸濁する。
次いで、細胞懸濁液を元のウェル内の残りの200〜250マイクロリットルの培地に加える。本文に記載されているように、単一細胞またはバルクRNAシークまたはRT-qPCRによる遺伝子発現分析のために、標的集団の免疫蛍光、フローサイトメトリー、またはFACS精製を使用して、遺伝子発現解析用のダウンストリーム分析を実行します。継代が正常に完了した後、健康で堅牢なオルガノイド培養は、新しく単離された陰窩が2〜4日以内に出芽した陰窩構造を形成するべきであることを明らかにした。
フローサイトメトリー分析は、RORγ−Tマウストランスジェニックレポーターラインから小腸ILC1を単離するために実施され、予想されるILCカウント範囲は、350〜3,500個の単離細胞であることが判明した。オルガノイドを播種した後、共培養物を免疫化学細胞化学によって可視化することができる。共焦点顕微鏡は、単独でILC1の存在下で培養された小腸オルガノイドの画像を明らかにした。
免疫細胞化学染色は、オルガノイドILC1共培養物中のゾヌラ閉塞タンパク質-1陽性上皮細胞のすぐ近くにCD45陽性ILC1の存在を明らかにする。フローサイトメトリーは、上皮細胞接着分子がオルガノイドの腸上皮細胞をマークし、CD45がILC1sをマークすることを実証した。フローサイトメトリープロットおよび免疫化学により、ILC1と共培養した場合の腸上皮細胞におけるCD44の発現増加が明らかになった。
RT-qPCR研究は、ILC1共培養がCD44バリアント6を特異的にアップレギュレートし、これはTGF−β1,2,3中和抗体によって阻害され、小腸オルガノイドのみの培養において組換えTGF−β1によってアップレギュレートされたことを示している。オルガノイドの操作中は、構造全体が確実に維持され、遠心分離後に構造が十分にペレット状になっていることを確認するために、穏やかであることが重要です。他の免疫成分および非免疫成分を添加することによってシステムの複雑さを増大させることによって、このインビトロシステムは、腸生物学におけるさらなる問題に対処するために使用することができる。
