이 프로토콜은 장 면역 세포와 상피 사이의 상호 작용을 연구하고 이러한 상호 작용이 장 항상성 및 염증에서 어떻게 조절 될 수 있는지 해부하는 중요한 도구를 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 상피 및 면역 생물학에서 질문을 해결하는 데 사용될 수있는 시험관내 모델의 감소에 의해 촉진 된 실험 조절의 절묘한 양입니다. 이 시스템은 이미 CD44 양성 상피 크립트의 확장에서 ILC1의 역할을 결정하는 데 사용되어 왔으며 염증 매개 위장 질환에 대한 우리의 이해를 더욱 발전시킬 잠재력을 가지고 있습니다.
시작하기 위해, 열 가교된 기저 세포외 매트릭스를 얼음 위에 놓고 해동시키고, 표준 조직 배양-처리된 24-웰 플레이트를 섭씨 37도 배양기에 위치시켜 예열한다. 그 후, 오가노이드를 함유하는 플레이트를 인큐베이터로부터 제거하고, 통과될 웰로부터 배지를 버린다. 그런 다음 500 마이크로 리터의 얼음처럼 차가운 고급 DMEM F12를 웰에 넣고 P-1000 팁을 사용하여 모든 웰에서 오가노이드를 15 밀리리터 튜브로 수확하십시오.
250 ~ 300 마이크로 리터의 얼음처럼 차가운 고급 DMEM F12로 웰 바닥을 헹구어 오가노이드가 우물에 남아 있지 않도록하고 수확 된 오가노이드가 들어있는 15 밀리리터 튜브에 풀링하십시오. 1 ~ 이틀 된 수확 된 오가노이드 펠릿을 얼음처럼 차가운 고급 DMEM F12 밀리리터에 재현탁하십시오. 선천적 림프성 세포 복제 샘플당 PBS2로 1.5밀리리터 튜브 하나를 프리코트하고, 이어서 예비코팅된 PBS2 팁을 사용하여, 대략 100 내지 200개의 오가노이드를 튜브 내로 분배한다.
PBS2 코팅된 P-1000 팁을 사용하여, 분류 단계로부터 계산된 바와 같이 500 ILC1s 이하의 부피를 오가노이드를 함유하는 PBS2 코팅된 1.5 밀리리터 튜브에 첨가한다. ILC1과 오가노이드를 섭씨 4도에서 5분 동안 300G에서 회전시키고 튜브 끝에 펠렛을 만드는 대신 튜브 내부의 가장자리를 따라 세포를 당기므로 작은 직경의 탁상 원심 분리기를 피하십시오. 그런 다음, 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 천천히 그리고 부드럽게 제거하고 샘플을 얼음 위에 놓는다.
튜브를 차가운 표면에 고정시키면서, 균일한 분포를 보장하기 위해 오가노이드 및 ILC를 30 마이크로리터의 열 가교 기저 세포외 매트릭스에 적어도 10-15회 재현탁시킨다. 열 가교 기저 세포외 매트릭스에 웰당 30마이크로리터의 ILC 오가노이드를 미리 가온된 24웰 또는 48웰 플레이트에 적용하여 단일 돔을 형성한다. 그 후, 플레이트를 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 10 ~ 20 분 동안 인큐베이터에 직접 놓습니다.
이어서, 임의의 원하는 실험 사이토카인 또는 차단 항체와 함께 웰 당 550 마이크로리터의 완전한 ILC1 배지를 첨가하고, 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 24시간 후, 플레이트를 인큐베이터로부터 부드럽게 제거하고, 플레이트가 조직 배양 후드에 1분 동안 앉게 하여 림프구가 침전되도록 한다. 200 ~ 250 마이크로 리터의 매체를 제거하고 24 웰 플레이트의 빈 웰에 넣으십시오.
거꾸로 된 현미경을 사용하여 상층액을 검사하여 림프구가 제거되지 않았는지 확인하십시오. 상청액이 맑으면 300 마이크로리터의 신선한 ILC1 배지를 원래의 웰에서 공동 배양에 첨가한다. 림프구가 상청액에 존재하는 경우, 섭씨 4도에서 3 내지 5분 동안 300 내지 400 G에서 원심분리하고, 펠렛을 300 마이크로리터의 신선한 ILC1 배지에 재현탁시킨다.
이어서, 세포 현탁액을 원래의 웰 내의 나머지 200 내지 250 마이크로리터의 배지에 첨가한다. 본문에 기재된 바와 같이 단일 세포 또는 벌크 RNA 탐색 또는 RT-qPCR에 의한 유전자 발현 분석을 위해 용해 완충액으로 표적 집단의 면역형광, 유세포 분석 또는 FACS 정제를 사용하여 하류 분석을 수행한다. 성공적으로 통과 한 후, 건강하고 견고한 오가노이드 문화는 새로 격리 된 지하실이 이틀에서 나흘 이내에 싹트는 토굴 구조를 형성해야한다는 것을 밝혀 냈습니다.
ROR 감마-T 뮤린 트랜스제닉 리포터 라인으로부터 소장 ILC1을 분리하기 위해 유세포 분석을 수행하였고, 예상되는 ILC 카운트 범위는 350 내지 3, 500개의 단리된 세포인 것으로 밝혀졌다. 오가노이드로 시딩된 후, 공동-배양은 면역화학 세포화학에 의해 가시화될 수 있다. 공초점 현미경 검사는 ILC1s의 존재하에 단독으로 배양되는 작은 장 오가노이드의 이미지를 밝혀 냈습니다.
면역-세포화학적 염색은 오가노이드 ILC1 공동 배양물에서 Zonula가 단백질-1-양성 상피 세포를 폐색시키는 것에 근접한 CD45 양성 ILC1의 존재를 드러낸다. 유세포 분석기는 상피 세포 부착 분자가 오가노이드의 장 상피 세포를 표시하는 반면, CD45는 ILC1을 표시한다는 것을 입증했습니다. 유세포 플롯 및 면역화학은 ILC1과 공동 배양할 때 장 상피 세포에서 CD44의 발현 증가를 밝혀냈다.
RT-qPCR 연구는 ILC1 공동배양이 구체적으로 상향조절된 CD44 변이체 6을 보여주는데, 이는 TGF-베타 1, 2, 3 중화 항체에 의해 억제되고, 소장-오가노이드-전용 배양물에서 재조합 TGF-베타1에 의해 상향조절되었다. 오가노이드의 조작 중에 온화하여 전체 구조가 유지되도록하고 원심분리 후 구조물이 충분히 펠릿화되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 다른 면역 및 비면역 성분을 추가함으로써 시스템 복잡성을 증가시킴으로써, 이 시험관내 시스템은 장 생물학에서 추가적인 질문을 해결하기 위해 사용될 수 있다.
