Ce protocole fournit un outil important pour étudier les interactions entre les cellules immunitaires intestinales et l’épithélium et pour disséquer comment ces interactions peuvent réguler l’homéostasie intestinale et l’inflammation. Le principal avantage de cette technique est la quantité exquise de contrôle expérimental facilitée par le modèle de réduction in vitro, qui peut être utilisé pour répondre à des questions en biologie épithéliale et immunitaire. Ce système a déjà été utilisé pour déterminer le rôle de l’ILC1 dans l’expansion des cryptes épithéliales CD44 positives et a le potentiel de faire progresser notre compréhension des maladies gastro-intestinales médiées par l’inflammation.
Pour commencer, placez la matrice extracellulaire basale à réticulation thermique sur la glace pour décongeler et préchauffer une plaque de 24 puits traitée par culture tissulaire standard en la plaçant dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Ensuite, retirez la plaque contenant des organoïdes de l’incubateur et jetez le support du puits pour le passer. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de DMEM F12 avancé glacé aux puits et, à l’aide d’une pointe P-1000, prélevez les organoïdes de tous les puits dans un tube de 15 millilitres.
Rincer le fond des puits avec 250 à 300 microlitres de DMEM F12 avancé glacé, en veillant à ce qu’aucun organoïde ne reste dans le puits et s’accumuler dans le tube de 15 millilitres contenant des organoïdes prélevés. Remettre en suspension la pastille organoïde prélevée d’un à deux jours dans un millilitre de DMEM F12 avancé glacé. Pré-enduire un tube de 1,5 millilitre avec PBS2 par échantillon de cellules lymphoïdes innées, puis à l’aide d’une pointe PBS2 pré-enduite, distribuer environ 100 à 200 organoïdes dans le tube.
À l’aide d’une pointe P-1000 revêtue de PBS2, ajoutez un volume d’au moins 500 ILC1 calculé à partir de l’étape de tri au tube de 1,5 millilitre revêtu de PBS2 contenant les organoïdes. Faites tourner l’ILC1 et les organoïdes à 300 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et assurez-vous d’éviter les centrifugeuses de table de petit diamètre, car elles tireront les cellules le long du bord de l’intérieur du tube au lieu de créer une pastille à l’extrémité du tube. Ensuite, retirez le surnageant lentement et doucement sans déranger la pastille et placez l’échantillon sur de la glace.
Tout en maintenant le tube sur une surface froide, remettez en suspension les organoïdes et l’ILC dans 30 microlitres de matrice extracellulaire basale thermoréticulante au moins 10 à 15 fois pour assurer une distribution uniforme. Appliquez 30 microlitres par puits d’organoïdes ILC dans la matrice extracellulaire basale de réticulation thermique sur une plaque préchauffée de 24 ou 48 puits pour former un seul dôme. Ensuite, placez la plaque directement dans l’incubateur pendant 10 à 20 minutes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Ensuite, ajoutez 550 microlitres de milieu ILC1 complet par puits avec les cytokines expérimentales ou les anticorps bloquants souhaités et incubez à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Après 24 heures, retirez doucement la plaque de l’incubateur et laissez la plaque reposer dans une hotte de culture tissulaire pendant une minute pour vous assurer que les lymphocytes sont déposés. Retirez 200 à 250 microlitres de média et placez-le dans un puits vide d’une plaque de 24 puits.
À l’aide d’un microscope inversé, vérifiez le surnageant pour vous assurer qu’aucun lymphocyte n’a été enlevé. Si le surnageant est clair, ajoutez 300 microlitres de milieu ILC1 frais à la co-culture dans le puits d’origine. Si des lymphocytes sont présents dans le surnageant, centrifuger à 300 à 400 G pendant trois à cinq minutes à quatre degrés Celsius et remettre la pastille dans 300 microlitres de milieu ILC1 frais.
Ensuite, ajoutez la suspension cellulaire aux 200 à 250 microlitres restants de milieu dans le puits d’origine. Effectuer une analyse en aval à l’aide de l’immunofluorescence, de la cytométrie en flux ou de la purification FACS des populations cibles dans un tampon de lyse pour l’analyse de l’expression génique par une recherche d’ARN unicellulaire ou en vrac ou RT-qPCR comme décrit dans le texte. Après l’achèvement réussi du passage, des cultures organoïdes saines et robustes ont révélé que les cryptes fraîchement isolées devraient former des structures de crypte naissantes dans les deux à quatre jours.
L’analyse cytométrique en flux a été effectuée pour isoler l’ILC1 de l’intestin grêle de la lignée de rapporteur transgéniques murins ROR gamma-T, et la plage de comptage de l’ILC attendue s’est avérée être de 350 à 3 500 cellules isolées. Après avoir été ensemencées avec des organoïdes, les co-cultures peuvent être visualisées par immunochimie cytochimique. La microscopie confocale a révélé les images d’organoïdes de l’intestin grêle qui sont cultivés seuls et en présence d’ILC1.
La coloration immuno-cytochimique révèle la présence d’ILC1 CD45 positif à proximité des cellules épithéliales protéiques 1 positives de Zonula occludens dans des co-cultures organoïdes ILC1. La cytométrie en flux a démontré que la molécule d’adhésion cellulaire épithéliale marque les cellules épithéliales intestinales dans les organoïdes, tandis que cd45 marque les ILC1. Le diagramme cytométrique en flux et l’immunochimie ont révélé une expression accrue de CD44 dans les cellules épithéliales intestinales lorsqu’elles sont co-cultivées avec ILC1.
Les études RT-qPCR montrent que la co-culture d’ILC1 a spécifiquement régulé à la hausse la variante 6 de CD44, qui a été inhibée par des anticorps neutralisants TGF-bêta 1, 2, 3 et régulée à la hausse par le TGF-bêta-bêta 1 recombinant dans des cultures d’organoïdes de l’intestin grêle uniquement. Il est important d’être doux lors de la manipulation des organoïdes pour s’assurer que l’ensemble des structures est maintenu et pour vérifier que les structures ont suffisamment granulé après centrifugation. En augmentant la complexité du système en ajoutant d’autres composants immunitaires et non immunitaires, ce système in vitro peut être utilisé pour répondre à d’autres questions en biologie intestinale.
