פרוטוקול זה מספק כלי משמעותי לחקר האינטראקציות בין תאי מערכת החיסון במעי לבין האפיתל ולניתוח האופן שבו אינטראקציות אלה עשויות לווסת את ההומאוסטזיס והדלקת במעיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הכמות המעודנת של שליטה ניסיונית המתאפשרת על ידי מודל ההפחתה במבחנה, אשר יכול לשמש כדי לענות על שאלות באפיתל ובביולוגיה חיסונית. מערכת זו כבר שימשה לקביעת תפקידו של ILC1 בהרחבת קריפטות אפיתל חיוביות ל-CD44, ויש לה פוטנציאל לקדם עוד יותר את הבנתנו של מחלות במערכת העיכול בתיווך דלקת.
כדי להתחיל, הניחו את המטריצה החוץ-תאית הבסיסית המקשרת תרמית על קרח כדי להפשיר ולחמם מראש צלחת סטנדרטית של 24 בארות שטופלה בתרבית רקמה על ידי הצבתה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מוציאים את הצלחת המכילה אורגנואידים מהאינקובטור ומשליכים את המדיה מהבאר שתועבר. לאחר מכן, הוסיפו 500 מיקרוליטרים של DMEM F12 מתקדם קר כקרח לבארות, ובאמצעות קצה P-1000, קטפו את האורגנואידים מכל הבארות לצינור של 15 מיליליטר.
שטפו את תחתית הבארות ב-250 עד 300 מיקרוליטרים של DMEM F12 מתקדם קר כקרח, והבטיחו שלא יישארו אורגנואידים בבאר ויתחברו לצינור 15 מיליליטר המכיל אורגנואידים שנקטפו. בצעו החייאה של כדור האורגנואידים שנקטף בן יום עד יומיים במיליליטר אחד של DMEM F12 מתקדם קר כקרח. ציפוי מקדים של צינור אחד של 1.5 מיליליטר עם PBS2 לכל מדגם לימפואידי מולד, ולאחר מכן באמצעות קצה PBS2 מצופה מראש, מפזרים כ-100 עד 200 אורגנואידים לתוך הצינור.
באמצעות קצה P-1000 מצופה PBS2, הוסף נפח של לא פחות מ- 500 ILC1s כפי שחושב משלב המיון לצינור 1.5 מיליליטר המצופה PBS2 המכיל את האורגנואידים. סובבו את ה-ILC1 ואת האורגנואידים ב-300 G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס והקפידו להימנע מצנטריפוגות שולחניות בקוטר קטן, מכיוון שהן ימשכו את התאים לאורך קצה פנים הצינור במקום ליצור כדור בקצה הצינור. לאחר מכן, הסר את ה-supernatant לאט ובעדינות מבלי להפריע לכדור והנח את הדגימה על הקרח.
תוך כדי החזקת הצינור על משטח קר, בצעו החייאה של האורגנואידים וה-ILC ב-30 מיקרוליטרים של מטריצה חוץ-תאית בסיסית צולבת תרמית לפחות 10 עד 15 פעמים כדי להבטיח חלוקה שווה. יש למרוח 30 מיקרוליטרים לכל באר של אורגנואידים מסוג ILC במטריצה החוץ-תאית הבסיסית בעלת הקישור התרמי לצלחת מחוממת מראש של 24 או 48 בארות כדי ליצור כיפה אחת. לאחר מכן, הניחו את הצלחת ישירות באינקובטור למשך 10 עד 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.
לאחר מכן, הוסיפו 550 מיקרוליטרים של מדיום ILC1 שלם לכל באר עם כל הציטוקינים הניסיוניים הרצויים או נוגדנים חוסמים ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, הסר בעדינות את הצלחת מהאינקובטור ואפשר לצלחת לשבת במכסה מנוע תרבית רקמה במשך דקה אחת כדי להבטיח שהלימפוציטים ישקעו. הסירו 200 עד 250 מיקרוליטרים של מדיה והניחו אותה בבאר ריקה של צלחת בת 24 בארות.
באמצעות מיקרוסקופ הפוך, בדוק את supernatant כדי לוודא כי לא הוסרו לימפוציטים. אם ה-supernatant ברור, הוסיפו 300 מיקרוליטרים של מדיום ILC1 טרי לתרבות המשותפת בבאר המקורית. אם לימפוציטים נמצאים בסופרנטנט, צנטריפוגה ב 300 עד 400 G במשך שלוש עד חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס והחזרת הכדור ב 300 מיקרוליטרים של מדיום ILC1 טרי.
לאחר מכן, הוסף את מתלי התא ל-200 עד 250 המיקרוליטרים הנותרים של המדיה בבאר המקורית. בצע ניתוח במורד הזרם באמצעות אימונופלואורסצנציה, ציטומטריית זרימה או טיהור FACS של אוכלוסיות מטרה לתוך מאגר ליזה לניתוח ביטוי גנים על ידי חיפוש RNA חד-תאי או בתפזורת או RT-qPCR כמתואר בטקסט. לאחר סיום מוצלח של המעבר, תרביות אורגנואידים בריאות וחזקות גילו כי הקריפטות המבודדות הטריות אמורות ליצור מבני קריפטה ניצנים תוך יומיים עד ארבעה ימים.
הניתוח הציטומטרי של הזרימה בוצע כדי לבודד את ה-ILC1 של המעי הדק מקו הכתבים המהונדסים ROR gamma-T murine, וטווח ספירת ה-ILC הצפוי נמצא כ-350 עד 3, 500 תאים מבודדים. לאחר שנזרעו עם אורגנואידים, ניתן לדמיין תרביות משותפות על ידי ציטוכימיה אימונוכימיה. מיקרוסקופיה קונפוקלית חשפה את התמונות של אורגנואידים במעיים קטנים שעוברים תרבית בלבד ובנוכחות ILC1s.
צביעה אימונו-ציטוכימית חושפת נוכחות של ILC1 חיובי ל-CD45 בסמיכות לתאי אפיתל חיוביים לחלבון Zonula occludens בתרביות משותפות של אורגנואידים ILC1. ציטומטריה של זרימה הראתה כי מולקולת הידבקות תאית אפיתלאלית מסמנת תאי אפיתל במעיים באורגנואידים, בעוד ש-CD45 מסמן ILC1s. החלקה הציטומטרית של הזרימה והאימונוכימיה חשפו ביטוי מוגבר של CD44 בתאי אפיתל במעיים כאשר הם עוברים תרבית משותפת עם ILC1.
מחקרי RT-qPCR מראים כי תרבית משותפת של ILC1 העלתה באופן ספציפי את הוויסות של CD44 גרסה 6, אשר עוכבה על ידי TGF-beta 1, 2, 3 מנטרל נוגדנים, והווסתה על ידי TGF-beta 1 רקומביננטי בתרביות מעיים-אורגנואידים-בלבד. חשוב להיות עדין במהלך המניפולציה של האורגנואידים כדי להבטיח שכל המבנים נשמרים ולבדוק שהמבנים התפשטו מספיק לאחר צנטריפוגה. על ידי הגדלת מורכבות המערכת על ידי הוספת מרכיבים חיסוניים ולא חיסוניים אחרים, ניתן להשתמש במערכת חוץ גופית זו כדי לענות על שאלות נוספות בביולוגיה של המעיים.
