يوفر هذا النموذج العضوي الجديد المشتق من الأسنان البشرية أول أداة قوية لفك رموز بيولوجيا الخلايا الجذعية للأسنان البشرية مع وجهات نظر نحو التطبيقات التجديدية للأسنان. في الوقت الحاضر ، يعد نموذج الأسنان العضوي هذا الأداة الوحيدة المتاحة لنمو وتوسيع الخلايا الجذعية الظهارية للأسنان البشرية بشكل موثوق وقوي. يمكن تطبيق هذا البروتوكول العضوي لإنشاء نماذج بحثية ، ليس فقط من الأسنان الصحية ، ولكن أيضا من الأسنان المريضة مثل أورام الأسنان والتأثير البكتيري.
قد يكشف استكشاف نماذج الأمراض هذه عن أهداف علاجية جديدة. هذا النموذج العضوي مفيد للغاية في فك رموز عملية تكوين المينا في الأسنان البشرية ، وقد يمكن من بناء أجزاء الأسنان مثل المينا لأغراض توليدية. ستوضح الإجراء لارا هيمريك ، طالبة الدكتوراه في مجموعتي البحثية.
للبدء ، اجمع الأضراس الثالثة مع بصيلات الأسنان المرتبطة بها في وسط التجميع الموضوع على الجليد وانقل محتوى الأنابيب إلى طبق بتري. امسك السن باستخدام ملاقط واعزل بصيلات الأسنان بعناية باستخدام شفرة جراحية. اغسل الدم المتبقي من بصيلات الأسنان عن طريق وضع أنسجة بصيلات الأسنان لفترة وجيزة في البئر الأول من الإيثانول بنسبة 70٪ لمدة 20 ثانية ، ثم انقله إلى صفيحة الإيثانول التالية لمدة 20 ثانية ثم إلى بئر الإيثانول الثالث.
استمر في شطفه في الآبار المالحة العازلة بالفوسفات ثلاث مرات متبوعة بشطف بصيلات الأسنان في بصيلات الأسنان الثلاثة المتبقية التي تجمع آبارا متوسطة لمدة أقصاها 20 دقيقة في المجموع. انقل بصيلات الأسنان المغسولة إلى طبق بتري جديد. قطع قطعة صغيرة من واحدة من بصيلات الأسنان لتثبيت بارافورمالديهايد وتخزينها في أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على 500 ميكرولتر من وسط التجميع لمدة أقصاها ست ساعات.
افرم بقية بصيلات الأسنان إلى قطع صغيرة وانقلها إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر يحتوي على أربعة ملليلترات من وسط التفكك المحمى مسبقا ، ثم احتضن الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين في حمام مائي. كل 15 دقيقة ، ماصة وسط تفكك بصيلات الأسنان وخلطها لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة زجاجية لتسريع تفكك الأنسجة. عندما لا يتم ملاحظة قطع من بصيلات الأسنان ، تابع التفكك باستخدام ماصة باستور ضيقة ومصقولة بالنار.
في غضون ذلك ، قم بإعداد 10 ملليلتر من الوسط A يحتوي على 100 ميكرولتر من DNase وأضف خمسة ملليلتر من هذا الوسط إلى كل أنبوب مع بصيلات الأسنان المنفصلة. احتضان لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. شطف الفلتر مع ملليلتر واحد من A.الجمع بين عدة أنابيب من بصيلات الأسنان المنفصلة من مريض واحد في هذه الخطوة والطرد المركزي تعليق الخلية المصفاة في 200 مرات غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
إزالة supernatant. أعد تعليق الكريات في ملليلتر واحد من الوسط المحدد الخالي من المصل وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 ملليلتر. حساب تركيز الخلية باستخدام عداد خلية آلي وحساب عدد الآبار التي يمكن زرعها.
يتكون المزيج النهائي من تعليق الخلية ومصفوفة الغشاء السفلي بنسبة 30 إلى 70. قم بإزالة الكمية المناسبة من supernatant وأعد تعليقها ببطء للحصول على نسبة 70 إلى 30 من مصفوفة الغشاء السفلي البارد إلى تعليق الخلية للطلاء. بمجرد إعادة تعليقه في مصفوفة الغشاء السفلي ، احتفظ بأنبوب الطرد المركزي الدقيق على الجليد لتجنب تصلب مصفوفة الغشاء السفلي.
ماصة 20 ميكرولتر من قطرات مصفوفة الغشاء السفلي في وسط لوحة الاستزراع المسخنة مسبقا 48 بئرا. اقلب الصفيحة رأسا على عقب وضعها لتتصلب في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 1.9٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. أضف مثبط كيناز المرتبط بالرو والأمفوتريسين B إلى وسط الأسنان العضوي وقم بتسخين الوسط مسبقا في حمام مائي 37 درجة مئوية.
خذ لوحة 48 بئرا من الحاضنة. ضعه في وضع مستقيم وأضف 250 ميكرولتر من الوسط المسرف المحضر مسبقا إلى كل بئر مع قطرة مصفوفة غشاء سفلي تحتوي على الخلايا وأعد اللوحة إلى حاضنة ثاني أكسيد الكربون. لتحديث الوسط ، قم بإمالة اللوحة بزاوية 45 درجة.
قم بإزالة الوسط السابق بلطف ، مع تجنب لمس قطرة مصفوفة الغشاء السفلي وإضافة 250 ميكرولتر من الوسط العضوي الجديد للأسنان المسخن مسبقا كل يومين إلى ثلاثة أيام. لتنفيذ مرور المواد العضوية ، قم بإزالة الوسط من الآبار مع المواد العضوية وتجمع ما يصل إلى أربعة آبار ملتقية. لجمع المواد العضوية ، أضف 400 ميكرولتر من الوسط المحدد الخالي من المصل البارد المثلج لكل بئر مباشرة على قطرة مصفوفة الغشاء وقم بماصة الوسط مرارا وتكرارا لأعلى ولأسفل حتى يتم إزاحة القطرة بأكملها.
إذا تم تجميع الآبار ، فقم بنقل 400 ميكرولتر من البئر الأول إلى البئر التالي لإزاحة القطرات العضوية التي تحتوي عليها. انقل مجموعة الطرد العضوي الذي تم إزاحته إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ميكرولتر وكرر إضافة وسط محدد خال من المصل حتى يتم جمع جميع الهياكل العضوية من الآبار. الطرد المركزي في 200 مرة غرام لمدة خمس دقائق عند 4 درجات مئوية.
قم بإزالة المادة الفائقة من أنبوب جهاز الطرد المركزي وأعد تعليق الكريات في أليكوت مسخن مسبقا من TrypLE Express. أضف 400 ميكرولتر من الوسط المحدد الخالي من المصل البارد المثلج لتعطيل الإنزيم وطرده مركزيا عند 200 مرة جم لمدة خمس دقائق عند 4 درجات مئوية. إزالة supernatant.
قم بتغطية طرف مسبقا بوسط محدد خال من المصل البارد وأعد تعليق الكريات العضوية في حالة معقمة. أعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من الوسط المحدد الخالي من المصل البارد المثلج لطريقة المرور المنخفض. ادفع طرف الماصة المفرغ بالكامل على الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الصغير لتقليل قطره.
ماصة لأعلى ولأسفل لمدة خمس دقائق لتعطيل المواد العضوية ميكانيكيا. بالنسبة لطريقة المرور الأعلى ، أعد تعليق الكريات في 700 ميكرولتر من الوسط المحدد الخالي من المصل البارد مع طرف P1000. أضف طرف P200 إلى طرف P1000 هذا وقم بتغطيته مسبقا بوسط محدد خال من المصل البارد المثلج.
منع تكوين فقاعة الهواء عن طريق ضبط إعداد حجم الماصة. تطمح إلى ما لا يقل عن 90٪ من الحجم المتوسط مع المواد العضوية والماصة صعودا وهبوطا لمدة خمس دقائق لتعطيل المواد العضوية ميكانيكيا. عادة ما تتطور المواد العضوية بعد أسبوعين من بذر خلايا جريب الأسنان.
المواد العضوية قابلة للتوسيع على المدى الطويل حتى 11 مقطعا. إن بذر حوالي 20،000 خلية لكل قطرة مصفوفة غشاء سفلي ينتج كثافة مثالية من المواد العضوية ، في حين أن بذر أعداد خلايا أعلى يؤدي إلى نمو عضوي دون المستوى الأمثل مع عضويات مماثلة بكثافة عالية جدا بسبب عدم كفاية المساحة للنمو. تظهر المواد العضوية المطورة مظهرا كثيفا وتحتوي على خلايا تعرض نسبة عالية من النواة الصبغية.
علاوة على ذلك ، تعبر المواد العضوية عن علامة ERM cytokeratin 14 التي تؤكد أصلها الظهاري وعلامات ERM المقترحة الأخرى ، مثل P63 و CD44 و integrin alpha-6. تعبر Organoids عن SOX2 ، وهي علامة DESC معروفة في الفئران. ومن المثير للاهتمام ، أن المكون الرئيسي لمصفوفة المينا ، الأميلوجينين ، يتم التعبير عنه أيضا في المواد العضوية.
تحتفظ المواد العضوية بالنمط الظاهري لجذع ERMM أثناء المرور كما هو موضح في التعبير المستقر للعلامات. من أجل النمو الأمثل للعضويات على المدى الطويل ، من الضروري استخدام طرق المرور الموصى بها أو طرق المرور المنخفضة أو طرق المرور الأعلى. بمجرد تشكيلها ، يمكن استخدام المواد العضوية للتدقيق في عملية تكوين الأميلو بشكل أكبر وترسب مصفوفة المينا الذي لم يتحقق حاليا في أبحاث طب الأسنان.
تمكن هذه التقنية من استكشاف بيولوجيا الخلايا الجذعية الظهارية للأسنان ، وعملية تكوين المينا ، والتفاعل مع اللحمة المتوسطة للأسنان ، وهو تفاعل ضروري لتشكيل الأسنان الصحيح.
