Este nuevo modelo de organoides derivados de dientes humanos proporciona la primera herramienta poderosa para descifrar la biología de las células madre dentales humanas con perspectivas hacia las aplicaciones regenerativas de los dientes. En la actualidad, este modelo de organoides dentales es la única herramienta disponible para crecer y expandir de manera confiable y robusta las células madre epiteliales de los dientes humanos. Este protocolo de organoides se puede aplicar para establecer modelos de investigación, no solo de dientes sanos, sino también enfermos como tumores dentales e impacto bacteriano.
La exploración de tales modelos de enfermedad puede descubrir nuevas dianas terapéuticas. Este modelo organoide es altamente instrumental en el desciframiento del proceso de formación del esmalte en el diente humano, y puede permitir la construcción de partes del diente como el esmalte con fines generativos. Demostrando el procedimiento estará Lara Hemeryck, estudiante de doctorado en mi grupo de investigación.
Para comenzar, recoja los terceros molares con folículos dentales asociados en el medio de recolección colocado sobre hielo y transfiera el contenido de los tubos a una placa de Petri. Sostenga el diente con una pinza y aísle cuidadosamente los folículos dentales con una cuchilla quirúrgica. Lave la sangre restante de los folículos dentales colocando brevemente los tejidos del folículo dental en el primer pocillo de etanol al 70% durante 20 segundos, luego transfiéralo a la siguiente placa de etanol de muerte durante 20 segundos y más adelante al tercer pozo de etanol.
Continúe enjuagándolo en pocillos salinos tamponados con fosfato tres veces, seguido de enjuagar los folículos dentales en los tres pocillos medios de recolección de folículos dentales restantes durante un máximo de 20 minutos en total. Transfiera los folículos dentales enjuagados a una nueva placa de Petri. Cortar un pequeño trozo de uno de los folículos dentales para una fijación de paraformaldehído y almacenarlo en un tubo de microcentrífuga que contenga 500 microlitros de medio de recolección durante un máximo de seis horas.
Picar el resto de los folículos dentales en trozos pequeños y transferirlos a un tubo de 15 mililitros que contiene cuatro mililitros de medio de disociación precalentado, luego incubar el tubo a 37 grados centígrados durante dos horas en baño de agua. Cada 15 minutos, pipetee el medio de disociación de los folículos dentales y mezcle hacia arriba y hacia abajo usando una pipeta de vidrio para acelerar la desintegración del tejido. Cuando ya no se observen trozos de folículos dentales, proceda con la disociación utilizando una pipeta Pasteur estrechada y pulida al fuego.
Mientras tanto, prepare 10 mililitros de medio A que contengan 100 microlitros de DNasa y agregue cinco mililitros de este medio a cada tubo con folículos dentales disociados. Incubar durante un minuto a temperatura ambiente. Enjuague el filtro con un mililitro de A medio.Combine los varios tubos de folículos dentales disociados de un paciente en este paso y centrifugue la suspensión celular filtrada a 200 veces g durante 10 minutos a 4 grados centígrados.
Retire el sobrenadante. Resuspender el pellet en un mililitro de medio definido sin suero y transferir la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Calcule la concentración de células utilizando un contador celular automatizado y calcule el número de pozos que se pueden sembrar.
La mezcla final se compone de suspensión celular y matriz de membrana basal en una proporción de 30 a 70. Retire la cantidad adecuada de sobrenadante y vuelva a suspenderla lentamente para obtener una proporción de 70 a 30 de matriz de membrana basal helada a suspensión celular para el revestimiento. Una vez resuspendido en la matriz de la membrana basal, mantenga el tubo de la microcentrífuga en hielo para evitar la solidificación de la matriz de la membrana basal.
Pipetear los 20 microlitros de gotas de matriz de membrana basal en el centro de la placa de cultivo precalentada de 48 pocillos. Voltee la placa boca abajo y colóquela para solidificarse en una incubadora de dióxido de carbono al 1.9% a 37 grados Celsius durante 20 minutos. Agregue el inhibidor de la quinasa asociado a rho y la anfotericina B al medio organoide dental y precaliente el medio en un baño de agua de 37 grados Celsius.
Tome la placa de 48 pocillos de la incubadora. Colóquelo en posición vertical y agregue 250 microlitros del medio preparado precalentado a cada pozo con una gota de matriz de membrana basal que contenga las células y devuelva la placa a la incubadora de dióxido de carbono. Para refrescar el medio, incline la placa en un ángulo de 45 grados.
Retire suavemente el medio anterior, evitando tocar la gota de la matriz de la membrana basal y agregue 250 microlitros de nuevo medio organoide dental precalentado cada dos o tres días. Para llevar a cabo el paso de los organoides, retire el medio de los pozos con organoides y acumule hasta cuatro pozos confluentes. Para recolectar los organoides, agregue 400 microlitros de medio definido sin suero helado por pozo directamente sobre la gota de la matriz de membrana y pipetee repetidamente el medio hacia arriba y hacia abajo hasta que se desaloje toda la gota.
Si los pozos están agrupados, transfiera los 400 microlitros del primer pozo al siguiente para desalojar las gotas que contienen el organoide. Transfiera el conjunto de organoides desalojados a un tubo de microcentrífuga de 1,5 microlitros y repita la adición de un medio definido sin suero hasta que todas las estructuras organoides se recojan de los pozos. Centrifugarlo a 200 veces g durante cinco minutos a 4 grados centígrados.
Retire el sobrenadante del tubo de la centrífuga y vuelva a suspender el pellet en una alícuota precalentada de TrypLE Express. Agregue 400 microlitros de medio definido sin suero helado para inactivar la enzima y centrifugarla a 200 veces g durante cinco minutos a 4 grados centígrados. Retire el sobrenadante.
Cubra previamente una punta con un medio definido sin suero helado y vuelva a suspender el gránulo organoide en condiciones estériles. Vuelva a suspender el pellet en 200 microlitros de medio definido libre de suero helado para el método de paso bajo. Empuje la punta de la pipeta completamente vacía contra la parte inferior del tubo de la micro centrífuga para reducir su diámetro.
Pipete hacia arriba y hacia abajo durante cinco minutos para interrumpir mecánicamente los organoides. Para el método de paso más alto, vuelva a suspender el pellet en 700 microlitros de medio definido sin suero helado con una punta P1000. Agregue una punta P200 a esta punta P1000 y cubra previamente con un medio definido sin suero helado.
Evite la formación de burbujas de aire ajustando el ajuste de volumen de la pipeta. Aspire al menos el 90% del volumen medio con organoides y pipeta hacia arriba y hacia abajo durante cinco minutos para interrumpir mecánicamente los organoides. Los organoides generalmente se desarrollan dos semanas después de la siembra de células del folículo dental.
Los organoides son expandibles a largo plazo hasta 11 pasajes. La siembra de alrededor de 20, 000 células por gota de matriz de membrana basal produce una densidad óptima de organoides, mientras que la siembra de un mayor número de células conduce a un crecimiento subóptimo de organoides con organoides similares a una densidad demasiado alta debido al espacio insuficiente para crecer. Los organoides desarrollados muestran una apariencia densa y contienen células que muestran una alta proporción nucleocitoplasmática.
Además, los organoides expresan el marcador ERM citoqueratina 14 confirmando su origen epitelial y otros marcadores ERM propuestos, como P63, CD44 e integrina alfa-6. Los organoides expresan SOX2, un conocido marcador DESC en ratones. Curiosamente, el componente principal de la matriz del esmalte, la amelogenina, también se expresa en los organoides.
Los organoides conservan su fenotipo de tallo ERMM durante el pasaje, como lo demuestra la expresión estable de los marcadores. Para un crecimiento óptimo de organoides a largo plazo, es esencial utilizar los métodos de paso recomendados o el paso bajo o los métodos de paso más alto. Una vez formados, los organoides se pueden utilizar para examinar más a fondo el proceso de amelogénesis y la deposición de la matriz del esmalte que actualmente no se logra en la investigación odontológica.
Esta técnica permite la exploración de la biología de las células madre epiteliales dentales, el proceso de formación del esmalte y la interacción con el mesénquima dental, una interacción esencial para la correcta formación de los dientes.
