Este novo modelo organoide derivado do dente humano fornece a primeira ferramenta poderosa para decifrar a biologia de células-tronco dentárias humanas com perspectivas para aplicações regenerativas dentárias. Atualmente, este modelo organoide dentário é a única ferramenta disponível para crescer e expandir de forma confiável e robusta células-tronco epiteliais. Este protocolo organoide pode ser aplicado para estabelecer modelos de pesquisa, não apenas de dentes saudáveis, mas também doentes, como tumores dentários e impacto bacteriano.
A exploração de tais modelos de doenças pode descobrir novos alvos terapêuticos. Este modelo organoide é altamente instrumental na decifração do processo de formação de esmalte no dente humano, podendo permitir a construção de partes dentárias como o esmalte para fins generativos. Demonstrando o procedimento estará Lara Hemeryck, doutoranda do meu grupo de pesquisa.
Para começar, colete os terceiros molares com folículos dentários associados no meio de coleta colocado no gelo e transfira o conteúdo dos tubos para uma placa de Petri. Segure o dente com uma pinça e isole cuidadosamente os folículos dentários usando uma lâmina cirúrgica. Lave o sangue restante dos folículos dentários colocando brevemente os tecidos folículos dentários no primeiro poço de 70% de etanol por 20 segundos, depois transfira-o para a próxima placa de etanol da morte por 20 segundos e mais para o terceiro poço de etanol.
Continue enxaguando-o em poços salinos tamponados com fosfato três vezes seguidos de enxaguar os folículos dentários nos três poços de coleta de folículos dentário restantes por um máximo de 20 minutos no total. Transfira os folículos dentários enxaguados para uma nova placa de Petri. Corte um pequeno pedaço de um dos folículos dentários para uma fixação de paraformaldeído e armazene-o em um tubo de microcentrifusagem contendo 500 microliters de meio de coleta por um máximo de seis horas.
Pique o resto dos folículos dentários em pequenos pedaços e transfira-os para um tubo de 15 mililitros contendo quatro mililitros de meio de dissociação pré-armado, em seguida, incubar o tubo a 37 graus Celsius por duas horas em banho-maria. A cada 15 minutos, pipeta os folículos dentários desintegráciação média e misture-se e para baixo usando uma pipeta de vidro para acelerar a desintegração do tecido. Quando pedaços de folículos dentários não forem mais observados, prossiga com a dissociação usando uma pipeta Pasteur estreita e polida pelo fogo.
Enquanto isso, prepare 10 mililitros de médio A contendo 100 microliters de DNase e adicione cinco mililitros deste meio a cada tubo com folículos dentário dissociados. Incubar por um minuto em temperatura ambiente. Enxágüe o filtro com um mililitro de médio A.Combine os vários tubos de folículos dentários dissociados de um paciente nesta etapa e centrifugar a suspensão celular filtrada a 200 vezes g por 10 minutos a 4 graus Celsius.
Remova o supernatante. Resuspenja a pelota em um mililitro de meio definido sem soro e transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrifus de 1,5 mililitro. Calcule a concentração celular usando um contador celular automatizado e calcule o número de poços que podem ser semeados.
A mistura final é composta de suspensão celular e matriz de membrana de porão em uma proporção de 30 a 70. Remova a quantidade apropriada de supernasce e resuspensá-lo lentamente para obter uma proporção de 70 a 30 de matriz de membrana de porão gelado para suspensão celular para chapeamento. Uma vez resuspendido na matriz de membrana do porão, mantenha o tubo de microcentrifuuge no gelo para evitar a solidificação da matriz da membrana do porão.
Pipet os 20 microliters de gotículas de matriz de membrana do porão no centro da placa de cultura pré-aquecido de 48 poços. Vire a placa de cabeça para baixo e coloque-a para solidificar em uma incubadora de dióxido de carbono de 1,9% a 37 graus Celsius por 20 minutos. Adicione o inibidor de quinase associado à roda e a anfotericina B ao meio organoide dentário e pré-aquecimento do meio em um banho de água de 37 graus Celsius.
Pegue a placa de 48 poços da incubadora. Coloque-o ereto e adicione 250 microliters do meio pré-armado preparado para cada poço com uma gotícula de matriz de membrana do porão contendo as células e devolva a placa à incubadora de dióxido de carbono. Para refrescar o meio, incline a placa em um ângulo de 45 graus.
Remova suavemente o meio anterior, evitando tocar na gotícula da matriz da membrana do porão e adicione 250 microliters de novo meio organoide dentário pré-armado a cada dois ou três dias. Para realizar a passagem dos organoides, remova o meio dos poços com organoides e acumule até quatro poços confluentes. Para coletar os organoides, adicione 400 microliters de meio definido sem soro frio por poço diretamente na gotícula da matriz da membrana e pipeta repetidamente o meio para cima e para baixo até que toda a gotícula seja desalojada.
Se os poços estiverem agrupados, transfira os 400 microliters do primeiro poço para o próximo para desalojar o organoide contendo gotículas. Transfira o conjunto organoide desalojado para um tubo de microcentrífuga de 1,5 microliter e repita a adição de meio definido sem soro até que todas as estruturas organoides sejam coletadas dos poços. Centrifuá-lo a 200 vezes g por cinco minutos a 4 graus Celsius.
Remova o supernatante do tubo de centrífuga e resuspenque a pelota em uma alíquota pré-enlata do TrypLE Express. Adicione 400 microliters de meio definido sem soro para inativar a enzima e centrífugue a 200 vezes g por cinco minutos a 4 graus Celsius. Remova o supernatante.
Pré-cubra uma ponta com meio definido sem soro e suspenda a pelota organoide em condições estéreis. Suspenda a pelota em 200 microliters de meio definido livre de soro gelado para o método de baixa passagem. Empurre a ponta de pipeta completamente esvaziada contra a parte inferior do tubo de micro centrífuga para reduzir seu diâmetro.
Pipeta para cima e para baixo por cinco minutos para interromper mecanicamente os organoides. Para o método de passagem mais alto, resuspenque a pelota em 700 microliters de meio definido sem soro frio com ponta P1000. Adicione uma dica P200 a esta ponta P1000 e pré-casaco com meio definido sem soro frio.
Evite a formação de bolhas de ar ajustando a configuração de volume da pipeta. Aspire pelo menos 90% do volume médio com organoides e pipeta para cima e para baixo por cinco minutos para interromper mecanicamente os organoides. Os organoides normalmente se desenvolvem duas semanas após a semeadura de células folículos dentárias.
Os organoides são expansíveis a longo prazo até 11 passagens. A semeadura de cerca de 20.000 células por gotícula de matriz de membrana porão produz uma densidade ideal de organoides, enquanto a semeadura de números celulares mais altos leva ao crescimento organoide subótimo com organoides semelhantes em densidade muito alta devido ao espaço insuficiente para crescer. Os organoides desenvolvidos mostram uma aparência densa e contêm células que apresentam uma alta proporção nucleocitoplasmática.
Além disso, os organoides expressam o marcador ERM citokeratin 14 confirmando sua origem epitelial e outros marcadores ERM propostos, como P63, CD44 e integrin alfa-6. Organoides expressam SOX2, um conhecido marcador DESC em camundongos. Curiosamente, o principal componente da matriz de esmalte, a amelogenina, também expressa nos organoides.
Os organoides mantêm seu fenótipo de haste ERMM durante a passagem, como mostrado pela expressão estável dos marcadores. Para o crescimento ideal de organoides a longo prazo, é essencial usar os métodos de passagem recomendados ou a passagem baixa ou os métodos de passagem mais elevados. Uma vez formados, os organoides podem ser usados para examinar ainda mais o processo de amelogênese e a deposição da matriz de esmalte atualmente não alcançada na pesquisa odontológica.
Essa técnica permite a exploração da biologia das células-tronco epiteliais dentárias, o processo de formação do esmalte e a interação com o mesenquime dentário, uma interação essencial para a correta formação do dente.
