这种新的人类牙齿衍生类器官模型提供了第一个强大的工具，可以破译人类牙齿干细胞生物学，并展望牙齿再生应用。目前，这种牙齿类器官模型是唯一可用来可靠和健壮地生长和扩增人类牙齿上皮干细胞的工具。这种类器官方案可以应用于建立研究模型，不仅来自健康，而且来自患病牙齿，如牙齿肿瘤和细菌影响。
探索这些疾病模型可能会发现新的治疗靶点。这种类器官模型在破译人牙中的牙釉质形成过程中起着非常重要的作用，并且可以用于生成目的构建牙釉质等牙齿部件。演示该程序的将是我的研究小组的博士生Lara Hemeryck。
首先，在放置在冰上的收集培养基中收集第三磨牙和相关牙囊，并将管的内容物转移到培养皿中。用镊子握住牙齿，并使用手术刀片小心地隔离牙囊。通过将牙齿卵泡组织短暂地放在70%乙醇的第一孔中20秒，然后将其转移到下一个死亡乙醇板20秒并进一步转移到第三个乙醇孔中，从而洗涤牙齿卵泡上的剩余血液。
继续在磷酸盐缓冲盐水孔中冲洗三次，然后在剩余的三个牙科卵泡收集培养基孔中冲洗牙囊，总共最多20分钟。将冲洗过的牙囊转移到新的培养皿中。切一小块牙科卵泡进行多聚甲醛固定，并将其储存在含有500微升收集培养基的微量离心管中，最长六小时。
将其余的牙囊切成小块，并将它们转移到含有四毫升预热解离培养基的15毫升管中，然后将管在37摄氏度下在水浴中孵育两小时。每15分钟，移液将牙囊解离培养基移液，并使用玻璃移液管上下混合以加速组织分解。当不再观察到牙齿毛囊碎片时，使用狭窄的，火抛光的巴斯德移液器进行解离。
同时，制备10毫升含有100微升DNase的培养基A，并向具有解离的牙囊的每个管中加入5毫升该培养基。在室温下孵育一分钟。用一毫升培养基A冲洗过滤器，在此步骤中将来自一名患者的几管解离的牙囊混合在一起，并在4摄氏度下以200倍g离心过滤的细胞悬浮液10分钟。
取出上清液。将沉淀重悬于一毫升无血清定义的培养基中，并将细胞悬浮液转移到1.5毫升微量离心管中。使用自动细胞计数器计算细胞浓度，并计算可接种的孔数。
最终的混合物由细胞悬液和基底膜基质组成，比例为30至70。除去适量的上清液并缓慢重悬，以获得70至30%的冰冷基底膜基质与细胞悬浮液的比例进行电镀。一旦重悬于基底膜基质中，将微量离心管保持在冰上，以避免基底膜基质凝固。
移液20微升的基底膜基质液滴在预热的48孔培养板的中心。将板倒置并放置以在37摄氏度的1.9%二氧化碳培养箱中固化20分钟。将 rho 相关激酶抑制剂和两性霉素 B 加入到牙齿类器官培养基中，并在 37 摄氏度的水浴中预热培养基。
从培养箱中取出48孔板。将其直立放置并向每个孔中加入250微升制备的预热培养基，其中包含含有细胞的基底膜基质液滴，并将板返回到二氧化碳培养箱中。要刷新介质，请将板倾斜 45 度角。
轻轻取出前一种培养基，同时避免接触基底膜基质液滴，每两到三天加入250微升新的预热牙齿类器官培养基。为了进行类器官的通过，用类器官从孔中取出培养基，并汇集最多四个汇合孔。为了收集类器官，每孔直接在膜基质液滴上加入400微升无冰冷血清的定义培养基，并反复上下移液，直到整个液滴脱落。
如果孔被池化，将400微升从第一个孔转移到下一个孔以移走含有类器官的液滴。将脱落的类器官组件转移到1.5微升微量离心管中，并重复添加无血清的确定培养基，直到从孔中收集所有类器官结构。在4摄氏度下以200倍g离心5分钟。
从离心管中取出上清液，并将沉淀重悬于TrypLE Express的预热等分试样中。加入400微升无冰冷血清的定义培养基以灭活酶，并在4摄氏度下以200倍g离心5分钟。取出上清液。
用冰冷的无血清定义培养基预先涂覆尖端，并在无菌状态下重新悬浮类器官颗粒。将沉淀重新悬浮在200微升冰冷的无血清定义培养基中，用于低通过方法。将完全清空的移液器吸头推向微型离心管的底部，以减小其直径。
上下移液五分钟，以机械方式破坏类器官。对于更高通道的方法，将沉淀重悬于700微升的无冰冷血清定义培养基中，并带有P1000尖端。在此 P1000 吸头上添加 P200 吸头，并预先涂上冰冷的无血清定义培养基。
通过调整移液器的音量设置来防止气泡形成。用类器官和移液管上下移动至少90%的培养基体积五分钟，以机械地破坏类器官。类器官通常在牙囊细胞接种后两周发育。
类器官可长期扩展至11个通道。每个基底膜基质液滴接种约20， 000个细胞会产生最佳的类器官密度，而接种较高的细胞数量会导致由于生长空间不足，在密度过高的情况下，类器官的生长不是最佳的。发育的类器官表现出致密的外观，并含有具有高核细胞质比的细胞。
此外，类器官表达ERM标记物细胞角蛋白14，确认其上皮起源和其他提出的ERM标记物，例如P63，CD44和整合素α-6。类器官表达SOX2，SOX2是小鼠中众所周知的DESC标记物。有趣的是，牙釉质基质的主要成分，amelogenin，也表达在类器官中。
类器官在传代过程中保持其ERMM茎性表型，如标记物的稳定表达所示。为了获得最佳的长期类器官生长，必须使用推荐的通过方法或低通道或高通道方法。一旦形成，类器官可用于进一步仔细检查造牙过程和牙釉质基质沉积，目前在牙科研究中尚未实现。
该技术能够探索牙齿上皮干细胞生物学，牙釉质形成过程以及与牙齿间充质的相互作用，这是正确牙齿形成所必需的相互作用。
