Ce nouveau modèle organoïde dérivé d’une dent humaine fournit le premier outil puissant pour déchiffrer la biologie des cellules souches dentaires humaines avec des perspectives d’applications régénératrices dentaires. À l’heure actuelle, ce modèle organoïde dentaire est le seul outil disponible pour développer et développer de manière fiable et robuste les cellules souches épithéliales des dents humaines. Ce protocole organoïde peut être appliqué pour établir des modèles de recherche, non seulement à partir de dents saines, mais aussi malades telles que les tumeurs dentaires et l’impact bactérien.
L’exploration de tels modèles de maladies pourrait permettre de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques. Ce modèle organoïde est très utile pour déchiffrer le processus de formation de l’émail dans la dent humaine et peut permettre la construction de parties dentaires telles que l’émail à des fins génératives. Lara Hemeryck, doctorante dans mon groupe de recherche, fera la démonstration de la procédure.
Pour commencer, collectez les troisièmes molaires avec les follicules dentaires associés dans le milieu de collecte placé sur la glace et transférez le contenu des tubes dans une boîte de Pétri. Tenez la dent avec une pince à épiler et isolez soigneusement les follicules dentaires à l’aide d’une lame chirurgicale. Lavez le sang restant des follicules dentaires en plaçant brièvement les tissus des follicules dentaires dans le premier puits d’éthanol à 70% pendant 20 secondes, puis transférez-le dans la plaque d’éthanol de mort suivante pendant 20 secondes et plus loin dans le troisième puits d’éthanol.
Continuez à le rincer trois fois dans des puits salins tamponnés au phosphate, puis rincez les follicules dentaires dans les trois puits de milieu de collecte des follicules dentaires restants pendant un maximum de 20 minutes au total. Transférer les follicules dentaires rincés dans une nouvelle boîte de Pétri. Coupez un petit morceau de l’un des follicules dentaires pour une fixation au paraformaldéhyde et conservez-le dans un tube de microcentrifugation contenant 500 microlitres de milieu de collecte pendant un maximum de six heures.
Hachez le reste des follicules dentaires en petits morceaux et transférez-les dans un tube de 15 millilitres contenant quatre millilitres de milieu de dissociation préavertissé, puis incubez le tube à 37 degrés Celsius pendant deux heures au bain-marie. Toutes les 15 minutes, pipettez le milieu de dissociation des follicules dentaires et mélangez de haut en bas à l’aide d’une pipette en verre pour accélérer la désintégration des tissus. Lorsque des morceaux de follicules dentaires ne sont plus observés, procédez à la dissociation à l’aide d’une pipette Pasteur rétrécie et polie au feu.
En attendant, préparez 10 millilitres de milieu A contenant 100 microlitres de DNase et ajoutez cinq millilitres de ce milieu à chaque tube avec des follicules dentaires dissociés. Incuber pendant une minute à température ambiante. Rincez le filtre avec un millilitre de milieu A.Combinez les plusieurs tubes de follicules dentaires dissociés d’un patient à cette étape et centrifugez la suspension cellulaire filtrée à 200 fois g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius.
Retirez le surnageant. Remettre la pastille dans un millilitre de milieu défini sans sérum et transférer la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Calculez la concentration cellulaire à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé et calculez le nombre de puits qui peuvent être ensemencés.
Le mélange final est composé d’une suspension cellulaire et d’une matrice de membrane basale dans un rapport de 30 à 70. Retirez la quantité appropriée de surnageant et remettez-la en suspension lentement pour obtenir un rapport de 70 à 30 de matrice de membrane basale glacée à la suspension cellulaire pour le placage. Une fois remis en suspension dans la matrice de la membrane basale, gardez le tube de microcentrifugeuse sur la glace pour éviter la solidification de la matrice de la membrane basale.
Pipettez les 20 microlitres de gouttelettes de matrice de membrane basale au centre de la plaque de culture préchauffée de 48 puits. Retournez la plaque à l’envers et placez-la pour la solidifier dans un incubateur à 1,9% de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ajouter l’inhibiteur de kinase rho-associé et l’amphotéricine B au milieu organoïde de la dent et préchauffer le milieu dans un bain-marie de 37 degrés Celsius.
Prenez la plaque de 48 puits de l’incubateur. Placez-le à la verticale et ajoutez 250 microlitres du milieu préaverti préparé à chaque puits avec une gouttelette de matrice de membrane basale contenant les cellules et retournez la plaque à l’incubateur de dioxyde de carbone. Pour rafraîchir le support, inclinez la plaque à un angle de 45 degrés.
Retirez doucement le milieu précédent, tout en évitant de toucher la gouttelette de la matrice de la membrane basale et ajoutez 250 microlitres de nouveau milieu organoïde dentaire préavertis tous les deux à trois jours. Pour effectuer le passage des organoïdes, retirez le milieu des puits avec des organoïdes et mettez en commun jusqu’à quatre puits confluents. Pour recueillir les organoïdes, ajoutez 400 microlitres de milieu défini sans sérum glacé par puits directement sur la gouttelette de matrice membranaire et pipetez à plusieurs reprises le milieu de haut en bas jusqu’à ce que la gouttelette entière soit délogée.
Si les puits sont regroupés, transférez les 400 microlitres du premier puits au suivant pour déloger les organoïdes contenant des gouttelettes. Transférer l’ensemble organoïde délogé dans un tube de microcentrifugation de 1,5 microlitre et répéter l’ajout d’un milieu défini sans sérum jusqu’à ce que toutes les structures organoïdes soient collectées dans les puits. Centrifugez-le à 200 fois g pendant cinq minutes à 4 degrés Celsius.
Retirez le surnageant du tube de centrifugeuse et remettez en suspension la pastille dans une aliquote préaverdie de TrypLE Express. Ajouter 400 microlitres de milieu défini sans sérum glacé pour inactiver l’enzyme et centrifuger à 200 fois g pendant cinq minutes à 4 degrés Celsius. Retirez le surnageant.
Pré-enduire une pointe avec un milieu défini sans sérum glacé et re-suspendre la pastille organoïde à l’état stérile. Remettez la pastille dans 200 microlitres de sérum glacé sans milieu défini pour la méthode à faible passage. Poussez l’embout de la pipette complètement vidé contre le fond du tube de microcentrifugation pour réduire son diamètre.
Pipette de haut en bas pendant cinq minutes pour perturber mécaniquement les organoïdes. Pour la méthode de passage plus élevé, remettez en suspension la pastille dans 700 microlitres de milieu défini sans sérum glacé avec une pointe P1000. Ajoutez une pointe P200 à cette pointe P1000 et pré-enrobez avec un milieu défini sans sérum glacé.
Empêchez la formation de bulles d’air en ajustant le réglage du volume de la pipette. Aspirez au moins 90% du volume moyen avec des organoïdes et pipette de haut en bas pendant cinq minutes pour perturber mécaniquement les organoïdes. Les organoïdes se développent généralement deux semaines après l’ensemencement des cellules folliculaires dentaires.
Les organoïdes sont extensibles à long terme jusqu’à 11 passages. L’ensemencement d’environ 20 000 cellules par gouttelette de matrice de membrane basale donne une densité optimale d’organoïdes, tandis que l’ensemencement d’un nombre plus élevé de cellules conduit à une excroissance organoïde sous-optimale avec des organoïdes similaires à une densité trop élevée en raison d’un espace insuffisant pour se développer. Les organoïdes développés montrent un aspect dense et contiennent des cellules présentant un rapport nucléocytoplasmique élevé.
De plus, les organoïdes expriment le marqueur ERM cytokératine 14 confirmant leur origine épithéliale et d’autres marqueurs ERM proposés, tels que P63, CD44 et intégrine alpha-6. Les organoïdes expriment SOX2, un marqueur DESC bien connu chez la souris. Fait intéressant, le composant principal de la matrice de l’émail, l’amélogénine, est également exprimé dans les organoïdes.
Les organoïdes conservent leur phénotype de tige ERMM pendant le passage, comme le montre l’expression stable des marqueurs. Pour une croissance optimale des organoïdes à long terme, il est essentiel d’utiliser les méthodes de passage recommandées ou les méthodes de passage bas ou les méthodes de passage supérieur. Une fois formés, les organoïdes peuvent être utilisés pour examiner plus avant le processus d’amélogenèse et le dépôt de matrice d’émail actuellement pas atteint dans la recherche en dentisterie.
Cette technique permet d’explorer la biologie des cellules souches épithéliales dentaires, le processus de formation de l’émail et l’interaction avec le mésenchyme dentaire, une interaction essentielle à la formation correcte des dents.
