מודל אורגנואידי חדש זה שמקורו בשיניים אנושיות מספק את הכלי רב העוצמה הראשון לפענוח הביולוגיה של תאי גזע דנטליים אנושיים עם פרספקטיבות כלפי יישומים רגנרטיביים של שיניים. נכון לעכשיו, מודל אורגנואיד השן הזה הוא הכלי היחיד הזמין לגדל ולהרחיב באופן אמין וחזק תאי גזע אפיתל שן אנושיים. ניתן ליישם פרוטוקול אורגנואידי זה כדי לבסס מודלים מחקריים, לא רק משיניים בריאות, אלא גם משיניים חולות כגון גידולים דנטליים והשפעה חיידקית.
חקר מודלים של מחלות כאלה עשוי לחשוף מטרות טיפוליות חדשות. מודל אורגנואידי זה מסייע מאוד בפענוח תהליך היווצרות האמייל בשן האנושית, ועשוי לאפשר בנייה של חלקי שיניים כגון אמייל למטרות גנרטיביות. תדגים את ההליך תהיה לארה המריק, דוקטורנטית בקבוצת המחקר שלי.
כדי להתחיל, לאסוף את הטוחנות השלישיות עם זקיקי שיניים הקשורים במדיום האיסוף הניח על קרח ולהעביר את התוכן של הצינורות לצלחת פטרי. החזיקו את השן עם פינצטה ובודדו בזהירות את הזקיקים הדנטליים באמצעות להב כירורגי. שטפו את הדם הנותר מהזקיקים הדנטליים על ידי הנחת רקמות הזקיקים הדנטליים לזמן קצר בבאר הראשונה של 70% אתנול למשך 20 שניות, ואז העבירו אותה לצלחת האתנול הבאה למשך 20 שניות והלאה לבאר האתנול השלישית.
יש להמשיך לשטוף אותו בבארות מלוחות עם מאגר פוספט שלוש פעמים ולאחר מכן לשטוף את הזקיקים הדנטליים בשלושת הזקיקים הדנטליים הנותרים לאסוף בארות בינוניות למשך 20 דקות לכל היותר. מעבירים את הזקיקים הדנטליים השטופים לצלחת פטרי חדשה. חותכים חתיכה קטנה של אחד הזקיקים הדנטליים לקיבוע פרפורמלדהיד ומאחסנים אותה בצינור מיקרו-סנטריפוג המכיל 500 מיקרוליטרים של מדיום איסוף למשך שש שעות לכל היותר.
מצמצמים את שאר זקיקי השיניים לחתיכות קטנות ומעבירים אותם לצינור של 15 מיליליטרים המכיל ארבעה מיליליטרים של מדיום דיסוציאציה מוכן מראש, ואז דוגרים את הצינור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים באמבט מים. כל 15 דקות, פיפטה את מדיום הדיסוציאציה של זקיקי השיניים ומערבבים למעלה ולמטה באמצעות פיפטה מזכוכית כדי להאיץ את התפוררות הרקמה. כאשר חתיכות של זקיקים דנטליים כבר לא נצפות, המשיכו עם הדיסוציאציה באמצעות פיפטת פסטר מצומצמת ומלוטשת באש.
בינתיים, להכין 10 מיליליטרים של בינוני A המכיל 100 מיקרוליטרים של DNase ולהוסיף חמישה מיליליטרים של מדיום זה לכל צינור עם זקיקי שיניים מנותקים. דגירה לדקה אחת בטמפרטורת החדר. יש לשטוף את המסנן במיליליטר אחד של A בינוני.שלבו את מספר הצינורות של זקיקי שיניים מנותקים ממטופל אחד בשלב זה וצנטריפוגה של תרחיף התא המסונן ב-200 פעמים גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
הסר את ה-supernatant. בצעו שימוש חוזר בכדור במיליליטר אחד של מדיום מוגדר ללא סרום והעבירו את תרחיף התא לצינור מיקרו-צנטריפוג של 1.5 מיליליטר. חשב את ריכוז התא באמצעות מונה תאים אוטומטי וחשב את מספר הבארות שניתן לזרוע.
התמהיל הסופי מורכב מתרחיף תאים ומטריצת קרום מרתף ביחס של 30 עד 70. הסר את הכמות המתאימה של סופרנטנט ובצע בו החייאה איטית כדי לקבל יחס של 70 ל-30 של מטריצת קרום מרתף קר כקרח לתרחיף התא לציפוי. לאחר ההחייאה במטריצת קרום המרתף, שמור את צינור המיקרוצנטריפוגה על קרח כדי למנוע התמצקות של מטריצת ממברנת המרתף.
פיפטה את 20 המיקרוליטרים של טיפות מטריצת קרום המרתף במרכז צלחת התרבית המחוממת מראש של 48 בארות. הופכים את הצלחת על פיה ומניחים אותה כך שתתמצק בחממת פחמן דו חמצני של 1.9% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. הוסיפו את מעכב קינאז ואמפוטריצין B הקשורים ל-rho למדיום האורגנואידי של השן והוסיפו את המדיום לפני החימום באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
קח את צלחת 48 הבאר מהאינקובטור. מניחים אותה זקופה ומוסיפים 250 מיקרוליטרים של המדיום המוכן מראש לכל באר עם טיפת מטריצה של קרום מרתף המכילה את התאים ומחזירים את הצלחת לחממת הפחמן הדו-חמצני. כדי לרענן את המדיום, הטה את הצלחת בזווית של 45 מעלות.
הסר בעדינות את המדיום הקודם, תוך הימנעות מלגעת בטיפת מטריצת ממברנת המרתף והוסף 250 מיקרוליטרים של מדיום אורגנואידי חדש של שיניים מעודנות מראש כל יומיים-שלושה. כדי לבצע את המעבר של האורגנואידים, להסיר את המדיום מן הבארות עם אורגנואידים מאגר עד ארבע בארות confluent. כדי לאסוף את האורגנואידים, הוסיפו 400 מיקרוליטרים של תווך מוגדר ללא סרום קר כקרח לבאר ישירות על טיפת מטריצת הממברנה, וטפטפו שוב ושוב את המדיום למעלה ולמטה עד שהטיפה כולה תפורק.
אם בארות מרוכזות, העבירו את 400 המיקרוליטרים מהבאר הראשונה לבאר הבאה כדי לעקור את האורגנואיד המכיל טיפות. מעבירים את מכלול האורגנואידים המנותקים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיקרוליטר וחוזרים על התוספת של תווך מוגדר ללא סרום עד שכל המבנים האורגנואידים נאספים מהבארות. צנטריפוגה זה ב 200 פעמים g במשך חמש דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
מוציאים את הסופרנט מצינור הצנטריפוגה ומחזירים את הכדור באליקוט מוכן מראש של טריפלה אקספרס. הוסיפו 400 מיקרוליטרים של מדיום מוגדר ללא סרום קר כקרח כדי להשבית את האנזים ולצנטריפוגה שלו ב-200 פעמים גרם במשך חמש דקות ב-4 מעלות צלזיוס. הסר את ה-supernatant.
מצפים מראש קצה עם תווך מוגדר ללא סרום קר כקרח ומניחים מחדש את הכדור האורגנואידי במצב סטרילי. השעו מחדש את הכדור ב-200 מיקרוליטרים של מדיום מוגדר ללא סרום קר כקרח לשיטת המעבר הנמוך. דחפו את קצה הפיפטה המרוקן לחלוטין לתחתית צינור המיקרו צנטריפוגה כדי להקטין את קוטרו.
פיפטה למעלה ולמטה במשך חמש דקות כדי לשבש מכנית את האורגנואידים. עבור שיטת המעבר הגבוהה יותר, החיזרו את הכדור ב-700 מיקרוליטרים של מדיום מוגדר ללא סרום קר כקרח עם קצה P1000. הוסיפו טיפ P200 לקצה P1000 זה והתכוננו מראש עם מדיום מוגדר ללא סרום קר כקרח.
מנע היווצרות בועות אוויר על ידי התאמת הגדרת עוצמת הקול של הפיפטה. לשאוף לפחות 90% מהנפח הבינוני עם אורגנואידים ופיפטה למעלה ולמטה במשך חמש דקות כדי לשבש מכנית את האורגנואידים. האורגנואידים מתפתחים בדרך כלל שבועיים לאחר זריעת תאי זקיק דנטליים.
האורגנואידים ניתנים להרחבה לטווח ארוך עד 11 קטעים. זריעה של כ-20, 000 תאים לכל טיפת מטריצת קרום מרתף מניבה צפיפות אופטימלית של אורגנואידים, בעוד שזריעה של מספרי תאים גבוהים יותר מובילה לצמיחת אורגנואידים לא אופטימלית עם אורגנואידים דומים בצפיפות גבוהה מדי בשל חוסר מספיק מקום לגדול. האורגנואידים שפותחו מראים מראה צפוף ומכילים תאים המציגים יחס נוקלוציטופלסמי גבוה.
יתר על כן, האורגנואידים מבטאים את סמן ERM cytokeratin 14 המאשר את מקור האפיתל שלהם וסמני ERM מוצעים אחרים, כגון P63, CD44 ואינטגרין אלפא-6. אורגנואידים מבטאים SOX2, סמן DESC ידוע בעכברים. מעניין, המרכיב העיקרי של מטריצת האמייל, amelogenin, לידי ביטוי גם באורגנואידים.
האורגנואידים שומרים על פנוטיפ גבעול ה-ERMM שלהם במהלך המעבר, כפי שמוצג על ידי הביטוי היציב של סמנים. עבור צמיחה אופטימלית של אורגנואידים לטווח ארוך, חיוני להשתמש בשיטות המעבר המומלצות שמשמעותן או במעבר הנמוך או בשיטות המעבר הגבוהות יותר. לאחר היווצרותם, ניתן להשתמש באורגנואידים כדי לבחון את תהליך האמלוגנזה עוד יותר ותצהיר מטריצת האמייל אינו מושג כיום במחקר רפואת שיניים.
טכניקה זו מאפשרת לחקור את הביולוגיה של תאי גזע אפיתל דנטליים, את תהליך היווצרות האמייל ואת האינטראקציה עם מזנכימי השן, יחסי גומלין החיוניים להיווצרות נכונה של שיניים.
