يسمح هذا البروتوكول بتقييم وظيفة الميتوكوندريا داخل العصب عن طريق تقسيم الميتوكوندريا المعزولة ، وهو إجراء صعب في نسيج صغير يحتوي على عدد محدود من الميتوكوندريا. توفر هذه التقنية إمكانية تحليل وظائف الميتوكوندريا مثل استهلاك الأكسجين وإنتاج ROS في وقت واحد في الميتوكوندريا المحفوظة في الموقع. مع العديد من الركائز والمثبطات وبروتوكولات تصميم غير المقترنة.
تشترك العديد من الأمراض في وظيفة الميتوكوندريا ، ولا سيما الاعتلالات العصبية الناجمة عن مرض السكري من النوع الثاني أو العلاج الكيميائي. في هذه الأمراض ، تعد ضعف الفسفرة التأكسدية للميتوكوندريا هي العلامة الوحيدة التي تملي تطور المرض. توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة في علم الأحياء العصبية والكيمياء الحيوية وعلم الأدوية ، مع التحقيق في آليات مرض الميتوكوندريا ، والبحث عن العلاجات ، مثل معززات الميتوكوندريا أو آلام الأعصاب المخففة.
للبدء ، قم بمعايرة مستشعرات الأكسجين عن طريق سحب 2.1 ملليلتر من المخزن المؤقت MR في كل غرفة. أغلقه بالسدادات واسحب الهواء إلى الغرفة حتى يتم تشكيل فقاعة. يحرك المزيج على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة في وضع المعايرة حتى يستقر تدفق الأكسجين لكل كتلة.
باستخدام برنامج HRR ، قم بإجراء معايرة الهواء لمستشعرات الأكسجين المستقطبة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لإعداد الأنسجة ، ضع العصب الوركي في طبق بتري مع ما يكفي من TP العازلة لتغطيته. امسك أحد طرفي العصب باستخدام ملقط ومع زوج آخر من الملقط اسحب الحزم العصبية أفقيا.
أولا ، انقل الأنسجة المعروضة إلى طبق صغير يحتوي على مخزن مؤقت TP ملليلتر واحد لتخلل الأنسجة. لبدء النفاذية ، انقل الأنسجة مع الملقط إلى طبق آخر يحتوي على ملليلتر واحد من TP buffer ، يحتوي على 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من الصابونين. ضع الطبق في شاكر صفيحة صغيرة واتركه يحرك بلطف لمدة 30 دقيقة.
ثم ، انقل الأنسجة مع الملقط إلى طبق طازج يحتوي على مخزن مؤقت MR ملليلتر واحد ، واتركه يحرك بلطف لمدة 10 دقائق. انقل الأنسجة باستخدام الملقط إلى غرفة HRR معايرة. املأ غرف HRR ب 2.1 ملليلتر من المخزن المؤقت MR.
أضف Amplex Red و peroxidase إلى تركيز نهائي من خمسة ميكرومولار ، ووحدتين لكل ملليلتر ، على التوالي. ثم أضف العصب الوركي القابل للاختراق. قم بتوصيل مستشعرات الفلورسنت الخاصة بالجهاز.
ثم ، أطفئ الأضواء في قسم التحكم في البرنامج وانقر فوق الاتصال ب oxygraph"انتقل إلى تحرير البروتوكولات" في البرنامج وأدخل وزن الأنسجة. انتقل إلى التخطيط واختر خيار التدفق المحدد لكل عينة وحدة. ثم حدد المؤامرات للوصول في وقت واحد إلى قراءة استهلاك الأكسجين ، وإذا لزم الأمر ، إنتاج بيروكسيد الهيدروجين.
انتظر لمدة 10 دقائق تقريبا. حقن نبضتين من بيروكسيد الهيدروجين ، كل واحدة إلى تركيز نهائي من 260 ميكرومولار لمعايرة الغرفة. حقن 20 ميكرولتر من السكسينات ، وهي ركيزة مجمع الميتوكوندريا II ، لتنشيط نظام نقل إلكترون الميتوكوندريا.
أضف 20 ميكرولتر من ADP لتنشيط توليف ATP. في التسلسل ، أضف خمسة ميكرولترات من السيتوكروم c كمؤشر على سلامة الغشاء. معايرة مع aliquots من 0.2 ميكروغرام لكل ملليلتر من oligomycin حتى لا يلاحظ أي انخفاض آخر في استهلاك الأكسجين.
معايرة مع aliquots من 0.5 ميكرومول لكل لتر FCCP ، والميتوكوندريا غير المقترنة ، حتى لا يلاحظ أي زيادة أخرى في استهلاك الأكسجين. لإنهاء التجربة ، قم بحقن ميكرولترين من antimycin A ، وقم بتركيز نهائي قدره خمسة ملليمولات وانتظر حتى يستقر التدفق. انتقل إلى شريط الأوامر.
البحث عن الحواس المتعددة"في البرنامج. انقر فوق عنصر التحكم"ثم اضغط على حفظ الملف"وقطع الاتصال. افتح الملف المحفوظ وحدد تدفق الأكسجين لكل صواني كتلة للحصول على نتائج استهلاك الأكسجين التجريبية.
حدد النافذة يدويا بين الحقن عن طريق الضغط على زر الماوس الأيسر shift plus left. انتقل إلى العلامات، وحدد الإحصائيات لتصور النتائج لكل حقنة من الركائز والمثبطات وبروتوكول فك الاقتران. لإنتاج بيروكسيد الهيدروجين تنفيذ نفس الإجراء مع تتبع منحدر أمبير.
أدى الانخفاض في إمكانات الغشاء التي يعززها نشاط سيثاز ATP إلى تسريع استهلاك الأكسجين. إن إضافة السيتوكروم C الخارجي المنشأ لم يعزز سوى الحد الأدنى من تحفيز التنفس ، مما يشهد على سلامة الغشاء الخارجي للميتوكوندريا لهذا التحضير. تم تسجيل تدفقات الأكسجين المطلقة ولوحظ زيادة بنسبة 6.3٪ فقط في التنفس ، مما يشير إلى نوعية جيدة من إعداد الأنسجة.
تم قياس استهلاك الأكسجين وإنتاج ROS في وقت واحد في وجود ركائز مختلفة توفر الوقود لنظام نقل الإلكترون. إضافة البيروفات والمالات لمجمع الميتوكوندريا أنا زيادة التنفس. وإضافة المزيد من السكسينات للمجمع II يزيد أيضا من استهلاك الأكسجين.
لذلك يمكن اختبار ركائز أخرى. كما زاد إنتاج ROS ، مما يشير إلى تسرب الأكسجين من نظام نقل الإلكترون. أدت إضافة الأدينوسين ثنائي الفوسفات في تركيز التشبع إلى زيادة استهلاك الأكسجين مما أدى إلى تكوين ATP ، وتقليل إنتاج ROS.
في المقابل ، قللت معايرة الأوليغو من استهلاك الأكسجين وزادت من إنتاج ROS. هذا يشير إلى أن العصب الوركي المتخلل يمكن أن يكرر العلاقة القياسية في فسيولوجيا الميتوكوندريا. تؤكد إضافة FCCP والريتينون ، المتوافقة مع التغيرات المتوقعة في تدفق الأكسجين ، أن فسيولوجيا الميتوكوندريا وملف الطاقة الحيوية قد تم الحفاظ عليهما في العصب الوركي المتغلغل.
الخطوة الأكثر أهمية هي إعداد قسم الأنسجة بلطف ، وضمان تنظيف جميع فتحات الغرفة بشكل صحيح. يمكن أن تكون التعديلات في وظيفة الميتوكوندريا بسبب خلل وظيفي أو انخفاض عدد الميتوكوندريا. لذلك يوصى باستخدام نشاط synthase المذكور وتأكيد محتوى الحمض النووي للميتوكوندريا بواسطة PCR.
