Bu protokol, sınırlı sayıda mitokondri içeren küçük bir dokuda zorlu bir prosedür olan izole mitokondrinin parselasyonu ile sinir içindeki mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesine izin verir. Bu teknik, oksijen tüketimi ve ROS üretimi gibi mitokondri fonksiyonlarını aynı anda korunmuş bir mitokondri in situ içinde analiz etme imkanı sağlar. Çoklu substratlar, inhibitörler ve uncoupler tasarım protokolleri ile.
Bazı hastalıklar mitokondriyal fonksiyonu, özellikle de tip iki diyabet veya kemoterapinin neden olduğu nöropatileri paylaşır. Bu hastalıklarda, mitokondriyal oksidatif fosforilasyonun bozulması, hastalık gelişimini belirleyen tek işarettir. Bu yöntem, mitokondriyal hastalık mekanizmalarının araştırılması, mitokondriyal güçlendiriciler veya iyileştirilmiş nöropatik ağrı gibi tedavilerin araştırılması ile nörobiyoloji, biyokimya ve farmakoloji hakkında fikir verir.
Başlamak için, her bir odaya 2,1 mililitre MR tamponu pipetleyerek oksijen sensörlerini kalibre edin. Tapalarla kapatın ve bir kabarcık oluşana kadar odaya hava çekin. Kütle başına oksijen akışı stabilize olana kadar kalibrasyon modunda bir saat boyunca 37 santigrat derecede karıştırın.
HRR yazılımını kullanarak, üreticinin talimatlarına göre polarografik oksijen sensörlerinin hava kalibrasyonunu gerçekleştirin. Doku hazırlığı için, siyatik siniri, onu örtmek için yeterli TP tamponuna sahip bir Petri kabına yerleştirin. Forseps ile sinirin bir ucunu tutun ve başka bir çift forseps ile sinir demetlerini yatay olarak çekin.
İlk olarak, görüntülenen dokuyu doku geçirgenliği için bir mililitre TP tamponu içeren küçük bir kaba aktarın. Permeabilizasyonu başlatmak için, forsepsli dokuyu, mililitre saponin başına 50 mikrogram içeren, bir mililitre TP tamponu içeren başka bir kaba aktarın. Plakayı bir mikro plaka çalkalayıcıya yerleştirin ve 30 dakika boyunca hafifçe karıştırın.
Daha sonra, forseps içeren dokuyu bir mililitre MR tamponu içeren taze bir kaba aktarın ve 10 dakika boyunca hafifçe karıştırın. Forseps ile dokuyu kalibre edilmiş bir HRR odasına aktarın. HRR odalarını 2,1 mililitre MR tamponu ile doldurun.
Amplex Red ve peroksidaz'ı sırasıyla beş mikromolar ve mililitre başına iki birim nihai konsantrasyonuna ekleyin. Ardından, geçirgen siyatik siniri ekleyin. Cihazın floresan sensörlerini takın.
Ardından, yazılımın kontrol bölümündeki ışıkları kapatın ve yazılımdaki oksigrafa bağlan'a tıklayın "Protokolleri düzenlemeye git" ve doku ağırlığını ekleyin. Mizanpaja gidin ve birim numune başına belirli akıyı seçin" seçeneği. Ardından, oksijen tüketimi okumasına ve gerekirse hidrojen peroksit üretimine aynı anda erişmek için grafikleri seçin.
Yaklaşık 10 dakika bekleyin. Odanın kalibrasyonu için her biri 260 mikromolar'lık son konsantrasyona iki hidrojen peroksit darbesi enjekte edin. Mitokondriyal elektron taşıma sistemini aktive etmek için bir mitokondriyal kompleks II substratı olan 20 mikrolitre süksinat enjekte edin.
ATP sentezini aktive etmek için 20 mikrolitre ADP ekleyin. Sırayla, membran bütünlüğünün bir göstergesi olarak beş mikrolitre sitokrom c ekleyin. Oksijen tüketiminde daha fazla azalma gözlenene kadar mililitre oligomisin başına 0.2 mikrogram alikotlarla titre edin.
Litre başına 0.5 mikromol alikotlu titre edici FCCP, mitokondriyal uncoupler, oksijen tüketiminde daha fazla artış gözlenmeyene kadar. Deneyi bitirmek için iki mikrolitre antimisin A enjekte edin, beş milimolar son konsantrasyonda yapın ve akışın stabilize olmasını bekleyin. Komut çubuğuna gidin.
Yazılımda "multisensory" araması yapın. Kontrol'e tıklayın", ardından dosyayı kaydet" e basın ve bağlantıyı kesin. Kaydedilen dosyayı açın ve deneysel oksijen tüketimi sonuçlarını elde etmek için kütle tepsileri başına oksijen akışını seçin.
Shift artı farenin sol düğmesine basarak enjeksiyonlar arasındaki pencereyi manuel olarak seçin. İşaretlere gidin ve her substrat, inhibitör ve uncoupler protokolü enjeksiyonunun sonuçlarını görselleştirmek için istatistikleri seçin. Hidrojen peroksit üretimi için amplifikatör eğim izi ile aynı prosedürü uygulayın.
ATP sitaz aktivitesi tarafından teşvik edilen membran potansiyelindeki azalma, oksijen tüketimini hızlandırdı. Eksojen sitokrom C'nin eklenmesi, solunumun sadece minimal uyarılmasını teşvik etti ve bu preparat için mitokondriyal dış membran bütünlüğünü onayladı. Mutlak oksijen akışları kaydedildi ve solunumda sadece% 6.3'lük bir artış gözlendi, bu da doku preparatının kalitesini gösterdi.
Oksijen tüketimi ve ROS üretimi, elektron taşıma sistemi için yakıt sağlayan farklı substratların varlığında aynı anda ölçüldü. Mitokondriyal kompleks için piruvat ve malat ilavesi solunumu arttırdı. Ve kompleks II için süksinat ilavesi de oksijen tüketimini arttırır.
Bu nedenle diğer substratlar test edilebilir. ROS üretimi de arttı ve elektron taşıma sisteminden oksijen sızıntısını gösterdi. Doygunluk konsantrasyonuna adenozin difosfat ilavesi, ATP oluşumunu tetikleyen oksijen tüketimini arttırdı ve ROS üretimini azalttı.
Buna karşılık, oligo titrasyonu oksijen tüketimini azalttı ve ROS üretimini artırdı. Bu, permeablize siyatik sinirin mitokondriyal fizyolojideki standart ilişkiyi kopyalayabileceğini düşündürmektedir. Beklenen oksijen akısı değişiklikleriyle uyumlu FCCP ve retinon ilavesi, mitokondriyal fizyolojinin ve biyoenerjetik profilin geçirgen siyatik sinirde korunduğunu doğrulamaktadır.
En önemli adım, doku bölümünü nazikçe hazırlamak, tüm oda açıklıklarının uygun şekilde temizlendiğinden emin olmaktır. Mitokondri fonksiyonundaki değişiklikler, işlev bozukluğuna veya daha düşük bir mitokondriyal sayıya bağlı olabilir. bu nedenle belirtilen sentaz aktivitesi ve PCR ile mitokondriyal DNA içeriği doğrulaması önerilmektedir.
