تسمح هذه البروتوكولات للباحثين بتجاوز مجرد قياس استهلاك الأكسجين في الميتوكوندريا ، وبدلا من ذلك تسمح بقياس المنتجات النهائية الرئيسية للميتوكوندريا ، ATP وأنواع الأكسجين التفاعلية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الباحث يمكنه قياس كفاءة الميتوكوندريا من خلال المقارنة المباشرة لمعدل استهلاك الأكسجين بمعدل إنتاج المنتج النهائي. ما إذا كان الناتج النهائي هو ATP أو الأكسجين التفاعلي.
تتطلب التقنيات اهتماما دقيقا للغاية بالتفاصيل ، لا سيما في تجنب الفقاعات. سواء كانت في غرفة التنفس أو محاقن المعايرة، فإن الفقاعات هي عدوك لأنها تجعل القياسات أقل دقة. بعد الحصول على خزعات العضلات والهيكل العظمي.
املأ غرف مقياس التنفس بوسائط خالية من المغنيسيوم وأغلق غرفة الحضانة. اضبط درجة حرارة حضانة الجهاز على 38 درجة مئوية لتمثيل درجة الحرارة القاعدية للعضلات الهيكلية للخيول. واضبط خلط وسائط التنفس على 750 دورة في الدقيقة باستخدام تقليب مغناطيسي يدور في الجزء السفلي من حجرة مقياس التنفس.
بعد ذلك ، قم بإيقاف تشغيل إضاءة الغرفة لتجنب التداخل مع مستشعرات الفلورسنت. قم بتنشيط قطب الأكسجين بجهد استقطاب 800 مللي فولت وقم بتضخيم الإشارة الناتجة بإعداد كسب واحد. سجل تركيز الأكسجين كل ثانيتين واحسب تدفق الأكسجين باعتباره الميل السالب لقياس الأكسجين خلال ال 40 ثانية التالية.
ثم قم بمعايرة مستشعر الأكسجين عن طريق السماح للوسائط بالتوازن مع هواء الغرفة. احسب الضغط الجزئي المرجعي للأكسجين بناء على الضغط الجوي المقاس بواسطة مقياس التنفس عالي الدقة وتركيز الأكسجين الجوي القياسي. استخدم مستشعرات الفلورسنت الخضراء لتحديد كمية إشارة الفلورسنت من غرفة التنفس.
قم بتنشيط المستشعرات عند 400 إلى 500 مللي فولت ويتم تضخيم الإشارة الناتجة بكسب من 1 إلى 1،000. بعد ذلك ، أضف TMRM إلى غرفة التنفس قبل إضافة الميتوكوندريا وقم بمعايرة إشارة الفلورسنت باستخدام معايرة بسيطة من نقطتين لإشارة الفلورسنت مقابل كمية الفلوروفور المضافة قبل إضافة الميتوكوندريا. إجراء المعايرة النهائية لإشارة TMRM بعد الانتهاء من بروتوكول معايرة قياس التنفس عن طريق إجراء عدة معايرات لعامل الفصل حتى لا تلاحظ أي زيادات أخرى في إشارة الفلورسنت TMRM مما يشير إلى الانهيار الكامل لإمكانات غشاء الميتوكوندريا.
استخدم مستشعرات الفلورسنت الزرقاء لتحديد إشارة الفلورسنت من غرفة التنفس وتنشيط هذه المستشعرات للأجهزة الفردية لالتقاط الإشارة المتوقعة ضمن النطاق الخطي للمستشعر. أضف ثمانية ميكرولترات من اثنين من المليمولار EDTA إلى غرفة الجهاز التنفسي لتحضير الكاتيونات التي من شأنها أن تتنافس مع أيونات المغنيسيوم للارتباط بالمغنيسيوم الأخضر. ثم أضف أربعة ميكرولترات من المليمولار الأخضر المغنيسيوم إلى غرفة التنفس.
قم بمعايرة إشارة الفلورسنت الخام بمعايرة متسلسلة 10 × 2 ميكرولتر من كلوريد المغنيسيوم 100 مللي مولار ، مما يسمح بدقيقة واحدة بين المعايرات لتثبيت إشارة الفلورسنت. حدد معدل تخليق ATTP وهو ميل تركيز ATP بمرور الوقت في جميع أنحاء البروتوكول. استخدم مستشعرات الفلورسنت الخضراء لتحديد كمية إشارة الفلورسنت من غرفة التنفس.
قم بتنشيط المستشعرات عند 300 إلى 400 مللي فولت. ويتم تضخيم الإشارة الناتجة بكسب من 1 إلى 1،000. قم بتحسين الإعدادات المحددة للأجهزة الفردية لالتقاط الإشارة المتوقعة ضمن النطاق الخطي للمستشعر.
قبل إضافة الميتوكوندريا ، قم بإجراء الإعداد الكيميائي والمعايرة الأولية لفحص Amplex UltraRed. أضف 30 ميكرومول من DTPA إلى الكاتيونات المخلبية التي قد تتداخل مع التفاعل. ثم أضف ديسموتاز الفائق أو بيروكسيديز سيراتوس و Amplex UltraRed في غرفة قياس التنفس.
اسمح لإشارة الفلورسنت بالاستقرار. ثم أضف 0.2 ميكرومول من بيروكسيد الهيدروجين مرتين بفجوة خمس دقائق. قم بإجراء معايرة إضافية من نقطتين طوال فترة الفحص للسماح بتعديل استجابة الفحص حيث تتغير كيمياء قياس التنفس طوال فترة الفحص مع التوقيت المحدد لنقاط المعايرة هذه وفقا لتقدير الباحث.
دوامة العينة للحفاظ على تعليق عينة موحدة وإضافة 15 ميكرولتر من تعليق الميتوكوندريا المعزولة إلى كل غرفة حضانة 2 ملليلتر بحيث تمثل النتائج العائد الميتوكوندريا من 18.75 ملليغرام من العضلات. قبل إضافة أي ركائز ، قم بقياس استهلاك الأكسجين المتبقي واطرح هذه القيمة من قيم استهلاك الأكسجين لكل خطوة في معايرة مثبط الركيزة غير المقترن أو بروتوكول SUIT بعد الانتهاء. استخدم بدلة للأغراض العامة تسمح بالتوصيف الأولي لوظيفة الميتوكوندريا في عضلات الهيكل العظمي للخيول.
ابدأ بمعايرة متسلسلة من البيروفات والغلوتامات والمالات بعضها ببعض في كل حجرة لإنتاج نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد وتحفيز التنفس غير الفسفري المدعوم ب NADH المؤكسد من خلال تسرب معقد أحادي القاعدة. ثم أضف جزيء ADP لتحفيز التنفس الفسفري من خلال التنفس الفسفرة المركب الواحد. إضافة السكسينات لإنتاج التنفس الفسفري عن طريق الجمع بين التنفس الفسفري المركب واحد والمعقد اثنين أضف الروتينون لحجب المركب واحد.
يمثل تدفق الأكسجين الناتج قدرة المركب الثاني على دعم استهلاك الأكسجين في الميتوكوندريا عن طريق أكسدة السكسينات وحدها. يظهر أثر قياس التنفس عالي الدقة لتنفس الميتوكوندريا في عضلات هيكل الخيول وجهد الغشاء النسبي. قيم التنفس للميتوكوندريا المحتضنة ب TMRM أقل بسبب التأثير المثبط لهذا الفلوروفور.
يتم عرض تنفس الميتوكوندريا وتخليق ATTP لعضلات الهيكل العظمي للخيول التي تحتوي على نسبة عالية من ألياف العضلات الهيكلية من النوع الأول الغنية بالميتوكوندريا والمحتضنة في ظل ظروف تقترب من التمثيل الغذائي أثناء الراحة. يظهر أثر قياس التنفس لتنفس الميتوكوندريا في عضلات الهيكل العظمي للخيول وإنتاج بيروكسيد الهيدروجين. يتطلب قياس التنفس عالي الدقة الكثير من الصبر.
سيكون لدى الشخص الذي يدير الفحص العديد من النقاط الزمنية التي يحتاج فيها إلى إجراء مكالمة حكم بشأن ما إذا كان قد تم الوصول إلى حالة مستقرة ويمكن أن تحدث الخطوة التالية. لقد أوضحنا بروتوكول معايرة واحد فقط. هناك العشرات من البروتوكولات التي يمكن تطبيقها بنفس الطريقة لمعالجة أسئلة محددة تتعلق باستقلاب الميتوكوندريا.
