Este protocolo permite la evaluación de la función mitocondrial dentro del nervio mediante la parcelación de las mitocondrias aisladas, un procedimiento desafiante en un tejido pequeño que contiene un número limitado de mitocondrias. La técnica ofrece la posibilidad de analizar las funciones de las mitocondrias, como el consumo de oxígeno y la producción de ROS, simultáneamente en una mitocondria preservada in situ. Con múltiples sustratos, inhibidores y protocolos de diseño de desacopladores.
Varias enfermedades comparten la función mitocondrial, en particular las neuropatías inducidas por la diabetes tipo dos o la quimioterapia. En estas enfermedades, las alteraciones de la fosforilación oxidativa mitocondrial es el único signo que dicta el desarrollo de la enfermedad. Este método proporciona información sobre neurobiología, bioquímica y farmacología, con la investigación de los mecanismos de la enfermedad mitocondrial, la búsqueda de terapias, como los refuerzos mitocondriales o el dolor neuropático mejorado.
Para comenzar, calibre los sensores de oxígeno canalizando 2,1 mililitros de tampón de RM en cada cámara. Ciérrelo con los tapones y extraiga aire hacia la cámara hasta que se forme una burbuja. Revuelva a 37 grados Celsius durante una hora en modo de calibración hasta que el flujo de oxígeno por masa se estabilice.
Utilizando el software HRR realice una calibración de aire de los sensores polarográficos de oxígeno de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la preparación del tejido, coloque el nervio ciático en una placa de Petri con suficiente tampón TP para cubrirlo. Sostenga un extremo del nervio con fórceps y con otro par de fórceps saque los haces nerviosos horizontalmente.
Primero, transfiera el tejido mostrado a un plato pequeño que contenga un tampón TP de mililitro para la permeabilización del tejido. Para iniciar la permeabilización, transfiera el tejido con fórceps a otro plato que contenga un mililitro de tampón TP, que contenga 50 microgramos por mililitro de saponina. Coloque la placa en un agitador de microplacas y déjela remover suavemente durante 30 minutos.
Luego, transfiera el tejido con fórceps a un plato fresco que contenga un tampón de RM de mililitros y déjelo remover suavemente durante 10 minutos. Transfiera el tejido con fórceps a una cámara HRR calibrada. Llene las cámaras HRR con 2,1 mililitros de tampón MR.
Agregue Amplex Red y peroxidasa a una concentración final de cinco micromolares y dos unidades por mililitro, respectivamente. Luego, agregue el nervio ciático permeable. Conecte los sensores fluorescentes del instrumento.
Luego, apague las luces en la sección de control del software y haga clic en conectar al oxígrafo"Ir a editar protocolos" en el software e inserte el peso del tejido. Vaya a diseño y elija la opción de flujo específico por unidad de muestra. Luego seleccione parcelas para acceder simultáneamente a la lectura del consumo de oxígeno y, si es necesario, a la producción de peróxido de hidrógeno.
Espere aproximadamente 10 minutos. Inyectar dos pulsos de peróxido de hidrógeno, cada uno a una concentración final de 260 micromolares para la calibración de la cámara. Inyectar 20 microlitros de succinato, un sustrato del complejo mitocondrial II, para activar el sistema de transporte de electrones mitocondrial.
Agregue 20 microlitros de ADP para activar la síntesis de ATP. En secuencia, agregue cinco microlitros de citocromo c como indicador de la integridad de la membrana. Valorar con alícuotas de 0,2 microgramos por mililitro de oligomicina hasta que no se observe una mayor disminución en el consumo de oxígeno.
Titula con alícuotas de 0,5 micromoles por litro FCCP, el desacoplador mitocondrial, hasta que no se observe un mayor aumento en el consumo de oxígeno. Para finalizar el experimento inyectar dos microlitros de antimicina A, hacer una concentración final de cinco milimolares y esperar a que el flujo se estabilice. Vaya a la barra de comandos.
Búsqueda de multisensorial" en el software. Haga clic en control"luego presione guardar archivo" y desconéctese. Abra el archivo guardado y seleccione el flujo de oxígeno por bandejas de masa para obtener los resultados experimentales de consumo de oxígeno.
Seleccione manualmente la ventana entre inyecciones presionando el botón shift plus left mouse. Vaya a marcas y seleccione estadísticas para visualizar los resultados de cada inyección de sustratos, inhibidores y protocolo de desacoplador. Para la producción de peróxido de hidrógeno realizar el mismo procedimiento con la traza de pendiente del amplificador.
La disminución del potencial de membrana promovida por la actividad de la ATP sitasa aceleró el consumo de oxígeno. La adición de citocromo C exógeno promovió solo una estimulación mínima de la respiración, certificando la integridad de la membrana externa mitocondrial para esta preparación. Se registraron flujos absolutos de oxígeno y solo se observó un aumento del 6,3% en la respiración, lo que indica una buena calidad de la preparación del tejido.
El consumo de oxígeno y la producción de ROS se midieron simultáneamente en presencia de diferentes sustratos que proporcionan combustible para el sistema de transporte de electrones. La adición de piruvato y malato para el complejo mitocondrial I aumentó la respiración. Y la adición adicional de succinato para el complejo II también aumenta el consumo de oxígeno.
Por lo tanto, se podrían probar otros sustratos. La producción de ROS también aumentó, lo que indica la fuga de oxígeno del sistema de transporte de electrones. La adición de difosfato de adenosina en la concentración saturante aumentó el consumo de oxígeno impulsando la formación de ATP y disminuyendo la producción de ROS.
Por el contrario, la titulación de oligo disminuyó el consumo de oxígeno y aumentó la producción de ROS. Esto sugirió que el nervio ciático permeablizado podría replicar la relación estándar en la fisiología mitocondrial. La adición de FCCP y retinona, alineados con los cambios esperados en el flujo de oxígeno, confirman que la fisiología mitocondrial y el perfil bioenergético se conservaron en el nervio ciático permeablizado.
El paso más importante es preparar suavemente la sección de tejido, asegurarse de que todas las aberturas de la cámara se limpien adecuadamente. Las alteraciones en la función mitocondrial podrían deberse a una disfunción o a un menor número mitocondrial. por lo tanto, se recomienda la actividad de la sintasa citada y la confirmación del contenido de ADN mitocondrial por PCR.
