Este protocolo permite a avaliação da função mitocondrial dentro do nervo por parcelamento das mitocôndrias isoladas, um procedimento desafiador em um pequeno tecido que contém um número limitado de mitocôndrias. A técnica oferece a possibilidade de analisar funções mitocôndrias como o consumo de oxigênio e a produção de ROS simultaneamente em uma mitocôndria preservada in situ. Com vários substratos, inibidores e protocolos de design desacopladores.
Várias doenças compartilham a função mitocondrial, em particular neuropatias induzidas pelo diabetes tipo dois ou quimioterapia. Nessas doenças, os prejuízos da fosforilação oxidativa mitocondrial é o único sinal que dita o desenvolvimento da doença. Este método fornece insights sobre neurobiologia, bioquímica e farmacologia, com a investigação de mecanismos de doença mitocondrial, busca de terapias, como reforços mitocondriais ou dor neuropática amenizada.
Para começar, calibrar os sensores de oxigênio tubondo 2,1 mililitros de amortecedor MR em cada câmara. Feche-a com as rolhas e desenhe ar para dentro da câmara até formar uma bolha. Mexa a 37 graus Celsius durante uma hora em modo de calibração até que o fluxo de oxigênio por massa se estabilize.
O software HRR realiza uma calibração de ar dos sensores polarográficos de oxigênio de acordo com as instruções do fabricante. Para a preparação do tecido, coloque o nervo ciático em uma placa de Petri com tampão TP suficiente para cobri-lo. Segure uma extremidade do nervo com fórceps e com outro par de fórceps puxe os feixes nervosos horizontalmente.
Primeiro, transfira o tecido exibido para um pequeno prato contendo um amortecedor TP mililitro para permeabilização tecidual. Para iniciar a permeabilização, transfira o tecido com fórceps para outro prato contendo um mililitro de tampão TP, contendo 50 microgramas por mililitro de saponina. Coloque a placa em um agitador de microplacos e deixe-a mexer suavemente por 30 minutos.
Em seguida, transfira o tecido com fórceps para um prato fresco contendo um amortecedor MR mililitro, e deixe-o mexer suavemente por 10 minutos. Transfira o tecido com fórceps para uma câmara HRR calibrada. Encha as câmaras HRR com 2,1 mililitros de buffer MR.
Adicione Amplex Vermelho e peroxidase a uma concentração final de cinco micromolar, e duas unidades por mililitro, respectivamente. Em seguida, adicione o nervo ciático permeável. Anexar os sensores fluorescentes do instrumento.
Em seguida, desligue as luzes na seção de controle do software e clique em conectar-se ao oxígrafo"Vá editar protocolos" no software e insira o peso do tecido. Vá para o layout e escolha a opção de fluxo por unidade específica". Em seguida, selecione parcelas para acessar simultaneamente a leitura do consumo de oxigênio e, se necessário, a produção de peróxido de hidrogênio.
Espere aproximadamente 10 minutos. Injete dois pulsos de peróxido de hidrogênio, cada um até uma concentração final de 260 micromolar para calibração da câmara. Injete 20 microliters de succinato, um substrato do complexo mitocondrial II, para ativar o sistema de transporte de elétrons mitocondrial.
Adicione 20 microliters de ADP para ativar a síntese ATP. Em sequência, adicione cinco microlitadores de citocromo c como um indicador de integridade da membrana. Titrate com alíquotas de 0,2 microgramas por mililitro de oligomicina até que não seja observada mais diminuição no consumo de oxigênio.
Titular com alíquotas de 0,5 micromoles por litro FCCP, o uncoupler mitocondrial, até que não seja observado mais aumento no consumo de oxigênio. Para terminar o experimento injete dois microliters de antimicina A, faça uma concentração final de cinco milimiliar e espere o fluxo estabilizar. Vá para a barra de comando.
Procure por multissensorial"no software. Clique no controle", em seguida, pressione salvar arquivo" e desconecte. Abra o arquivo salvo e selecione o fluxo de oxigênio por bandejas em massa para obter os resultados experimentais de consumo de oxigênio.
Selecione manualmente a janela entre as injeções pressionando o botão do mouse esquerdo mais o botão esquerdo do mouse. Vá para marcas e selecione estatísticas para visualizar os resultados de cada injeção de substratos, inibidores e protocolo de desacoplamento. Para produção de peróxido de hidrogênio, realize o mesmo procedimento com o traço de inclinação de amplificador.
A diminuição do potencial de membrana promovida pela atividade de sythase atp acelerou o consumo de oxigênio. A adição de citocromo exógeno C promoveu apenas uma estimulação mínima da respiração, certificando a integridade da membrana externa mitocondrial para esta preparação. Foram registrados fluxos absolutos de oxigênio e observado apenas um aumento de 6,3% na respiração, indicando boa qualidade da preparação do tecido.
O consumo de oxigênio e a produção de ROS foram medidos simultaneamente na presença de diferentes substratos que fornecem combustível para o sistema de transporte de elétrons. A adição de piruvato e malato para complexo mitocondrial eu aumentei a respiração. E a adição adicional de succinato para o complexo II também aumenta o consumo de oxigênio.
Portanto, outros substratos poderiam ser testados. A produção de ROS também aumentou, indicando o vazamento de oxigênio do sistema de transporte de elétrons. A adição de difosfato de adenosina na concentração saturada aumentou o consumo de oxigênio impulsionando a formação de ATP e diminuindo a produção de ROS.
Em contrapartida, a titulação do oligo diminuiu o consumo de oxigênio e aumentou a produção de ROS. Isso sugere que o nervo ciático do tamanho permeablado poderia replicar a relação padrão na fisiologia mitocondrial. A adição de FCCP e retinone, alinhada com as mudanças esperadas do fluxo de oxigênio, confirmam que a fisiologia mitocondrial e o perfil bioenergéstico foram preservados no nervo ciático do tamanho permeablístico.
O passo mais importante é preparar suavemente a seção tecidual, garantir que todas as aberturas das câmaras sejam devidamente limpas. Alterações na função mitocôndria podem ser devido a disfunção ou um número mitocondrial mais baixo. portanto, recomenda-se a atividade de synthase e a confirmação do conteúdo de DNA mitocondrial pelo PCR.
