Этот протокол позволяет оценить митохондриальную функцию внутри нерва путем парцелляции изолированных митохондрий, сложной процедуры в небольшой ткани, которая содержит ограниченное количество митохондрий. Метод обеспечивает возможность анализа функций митохондрий, таких как потребление кислорода и выработка АФК одновременно в сохраненных митохондриях in situ. С несколькими субстратами, ингибиторами и протоколами проектирования разъединителей.
Некоторые заболевания имеют общую митохондриальную функцию, в частности невропатии, вызванные диабетом второго типа или химиотерапией. При этих заболеваниях нарушения митохондриального окислительного фосфорилирования являются единственным признаком, который диктует развитие болезни. Этот метод дает представление о нейробиологии, биохимии и фармакологии, с исследованием механизмов митохондриальных заболеваний, поиском методов лечения, таких как митохондриальные бустеры или улучшение невропатической боли.
Для начала откалибруйте датчики кислорода, пипетировав 2,1 миллилитра буфера MR в каждую камеру. Закройте его пробками и втягивайте воздух в камеру, пока не образуется пузырь. Перемешивайте при 37 градусах Цельсия в течение одного часа в режиме калибровки до стабилизации потока кислорода на массу.
С помощью программного обеспечения HRR выполните воздушную калибровку полярографических датчиков кислорода в соответствии с инструкциями производителя. Для приготовления ткани поместите седалищный нерв в чашку Петри с достаточным количеством буфера TP, чтобы покрыть его. Удерживайте один конец нерва щипцами и другой парой щипцов вытягивайте нервные пучки горизонтально.
Во-первых, перенесите отображаемую ткань в небольшую посуду, содержащую один миллилитр TP буфера для пермеабилизации ткани. Чтобы начать пермеабилизацию, перенесите ткань щипцами в другую посуду, содержащую один миллилитр буфера ТП, содержащего 50 мкг на миллилитр сапонина. Поместите тарелку в микропластинчатый шейкер и дайте ей осторожно помешиваться в течение 30 минут.
Затем переложите ткань щипцами в свежую посуду, содержащую один миллилитр МР-буфера, и дайте ей мягко помешиваться в течение 10 минут. Перенесите ткань щипцами в калиброванную камеру HRR. Заполните камеры HRR 2,1 миллилитра буфера MR.
Добавьте Amplex Red и пероксидазу до конечной концентрации пяти микромоляров и двух единиц на миллилитр соответственно. Затем добавьте проницаемый седалищный нерв. Подключите флуоресцентные датчики прибора.
Затем выключите свет в разделе управления программного обеспечения и нажмите на подключение к оксиграфу «Перейти к редактированию протоколов» в программном обеспечении и вставьте вес ткани. Перейдите к макету и выберите конкретный поток на единицу образца". Затем выберите участки для одновременного доступа к показаниям потребления кислорода и, при необходимости, к производству перекиси водорода.
Подождите примерно 10 минут. Введите два импульса перекиси водорода, каждый до конечной концентрации 260 микромоляров для калибровки камеры. Введите 20 микролитров сукцината, субстрата митохондриального комплекса II, чтобы активировать митохондриальную систему переноса электронов.
Добавьте 20 микролитров АДФ для активации синтеза АТФ. В последовательности добавляют пять микролитров цитохрома c в качестве индикатора целостности мембраны. Титруйте аликвотами по 0,2 мкг на миллилитр олигомицина до тех пор, пока дальнейшего снижения потребления кислорода не наблюдается.
Титруйте с аликвотами 0,5 мкмоль на литр FCCP, митохондриального разъединителя, до тех пор, пока не наблюдается дальнейшего увеличения потребления кислорода. Чтобы закончить эксперимент, вводят два микролитра антимицина А, делают конечную концентрацию пяти миллимоляров и ждут, пока поток стабилизируется. Перейдите на панель команд.
Поиск мультисенсорности» в программном обеспечении. Нажмите на элемент управления", затем нажмите сохранить файл" и отключитесь. Откройте сохраненный файл и выберите поток кислорода на лотки для массы, чтобы получить экспериментальные результаты потребления кислорода.
Вручную выберите окно между инъекциями, нажав shift плюс левую кнопку мыши. Перейдите к отметкам и выберите статистику, чтобы визуализировать результаты для каждой инъекции субстратов, ингибиторов и протокола разъединителя. Для производства перекиси водорода выполняют ту же процедуру со следом наклона усилителя.
Снижение мембранного потенциала, чему способствовала активность АТФ-ситазы, ускоряло потребление кислорода. Добавление экзогенного цитохрома С способствовало лишь минимальной стимуляции дыхания, сертифицируя целостность наружной мембраны митохондрий для этого препарата. Были зафиксированы абсолютные потоки кислорода и наблюдалось увеличение дыхания только на 6,3%, что свидетельствует о хорошем качестве тканевого препарата.
Потребление кислорода и выработка АФК измерялись одновременно в присутствии различных подложек, обеспечивающих топливо для системы переноса электронов. Добавление пирувата и малата для митохондриального комплекса I усиливало дыхание. А дальнейшее добавление сукцината для комплекса II также увеличивает потребление кислорода.
Поэтому могут быть протестированы и другие субстраты. Производство ROS также увеличилось, что указывает на утечку кислорода из электронной транспортной системы. Добавление аденозиндифосфата в насыщенную концентрацию увеличивало потребление кислорода, приводящее к образованию АТФ, и уменьшало выработку АФК.
Напротив, титрование олиго уменьшило потребление кислорода и увеличило производство АФК. Это говорит о том, что пермеаблированный седалищный нерв может воспроизводить стандартное соотношение в митохондриальной физиологии. Добавление FCCP и ретинона, согласованное с ожидаемыми изменениями потока кислорода, подтверждает, что митохондриальная физиология и биоэнергетический профиль были сохранены в пермеаблированном седалищном нерве.
Самым важным шагом является аккуратная подготовка среза ткани, обеспечение правильной очистки всех отверстий камеры. Изменения функции митохондрий могут быть вызваны дисфункцией или более низким митохондриальным числом. поэтому рекомендуется цитировать активность синтазы и подтверждение содержания митохондриальной ДНК с помощью ПЦР.
