يهدف هذا البروتوكول إلى استخدام أعضاء الدماغ لدراسة أمراض الميتوكوندريا. وقد تم تطويره لتوليد organoids الدماغ القابلة للاستنساخ في تقييم خصائص الميتوكوندريا الخاصة بهم. ولا تتطلب هذه الطريقة مفاعلات حيوية باهظة الثمن وإجراءات تضمين تستغرق وقتا طويلا.
لذلك، فمن السهل لتنفيذ والراقية. هذا البروتوكول يجعل من الممكن لتوليد organoids الدماغ استنساخها واختبار خصائصها الميتوكوندريا. وهذا يمكن أن يؤدي إلى تحديد الأهداف التدخلية لأمراض الميتوكوندريا التي لا يمكن علاجها.
للبدء، ثقافة iPSCs الإنسان في ظل ظروف خالية من التغذية في المتوسط iPSC على لوحات المغلفة ست آبار والاحتفاظ بها في حاضنة زراعة الأنسجة الرطبة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. مرور iPSCs في التقاء 80٪ باستخدام انزيم خالية مفرزة المتوسطة في نسب تتراوح بين واحد من أربعة إلى واحد في 12. لزيادة بقاء الخلية، أضف 10 كيناز البروتين المرتبط بالميكرومولار أو مثبط ROCK بعد كل تقسيم.
فصل 80٪ iPSCs في اليوم صفر. إعداد التمايز القشري المتوسطة أو CDM1 وقبل الحارة في درجة حرارة الغرفة قبل إضافته إلى الخلايا. غسل الآبار التي تحتوي على iPSCs مع برنامج تلفزيوني لإزالة الخلايا الميتة والحطام.
أضف 500 ميكرولتر من الكاشف A الذي تم تسخينه مسبقا إلى كل بئر واحتضنه لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. تحقق تحت المجهر لضمان انفصال الخلية. إضافة ملليلتر واحد من iPSC المتوسطة لتخفيف الكاشف A لتحييد نشاطها.
استخدام ماصة 1,000 ميكرولتر لتفكيك الخلايا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر. طرد مركزي بلطف iPSCs في 125 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم يستنشق بعناية supernatant لتجنب إزعاج بيليه الخلية. إعادة إنفاق بيليه مع ملليلتر واحد من CDM1 للحصول على تعليق خلية واحدة والعد رقم الخلية.
إعداد المتوسطة البذر مع 9,000 iPSCs لكل 100 ميكرولتر في CDM1 تكملها 20 ميكرومولار روك المانع, ثلاثة ميكرومولار WNT كاتينين المانع أو IWR-1, وخمسة ميكرومولار SB-431542. إضافة 100 ميكرولتر من البذر المتوسطة لكل بئر إلى لوحة أسفل V 96 جيدا. احتفظ بالطبق في حاضنة زراعة الأنسجة الرطبة عند 37 درجة مئوية و5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
لتوليد الخلايا العصبية، في اليوم الأول، لاحظ أن المجاميع الخلايا المستديرة مع حدود سلسة محددة تتشكل. لاحظ الخلايا الميتة حول التجميعات. مواصلة الثقافة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
في اليوم الثالث، قم بإثارة اللوحة عن طريق النقر على الجانبين ثلاث مرات لفصل الخلايا الميتة، ثم أضف 100 ميكرولتر من CDM1 المكملة ب 20 مثبط MICROMOLAR ROCK، وثلاثة ميكرومولار IWR-1، وخمسة ميكرومولار SB-431542 لكل بئر. احتفظ بالطبق إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية و5٪ من ثاني أكسيد الكربون. في اليوم السادس، قم بإزالة 80 ميكرولتر من الوسيط الفائق بعناية من كل بئر.
تجنب لمس الجزء السفلي من البئر. إضافة 100 ميكرولتر من CDM1 تكملها ثلاثة ميكرومولار IWR-1 وخمسة ميكرومولار SB-431542 إلى كل بئر واحتضان لوحة. كرر الخطوة السابقة بعد كل ثلاثة أيام حتى اليوم 18.
في اليوم 18، لنقل الخلايا العصبية، وإعداد CDM2 وإضافة 10 ملليلتر إلى لوحة ثقافة الخلية مرفق 100 ملليمتر منخفضة جدا. استخدام ماصة 200 ميكرولتر مع تلميح قطع لنقل neurospheres الجولة من لوحة 96 جيدا إلى لوحة ثقافة الخلية مرفق 100 ملليمتر منخفضة جدا. إزالة خمسة ملليلتر من المتوسطة من لوحة تحتوي على الأعصاب وإضافة خمسة ملليلتر من CDM2 الطازجة.
ضع اللوحة على شاكر مداري بمعدل 70 دوران في الدقيقة داخل حاضنة زراعة الأنسجة الرطبة عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون. كل ثلاثة أيام، يستنشق بعناية المتوسطة فائقة واستبدالها CDM2 جديدة. اترك كمية صغيرة من الوسط لمنع الغلاف العصبي من الجفاف.
في اليوم 35، قم بإعداد CDM3. يستنشق المتوسط من لوحة وإضافة 10 ملليلتر من CDM3 الباردة. بعد تغيير الوسط، ضع اللوحة مرة أخرى على شاكر مداري بمعدل 70 دوران في الدقيقة داخل حاضنة زراعة الأنسجة الرطبة عند 37 درجة مئوية و5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
تغيير المتوسط كل ثلاثة إلى خمسة أيام اعتمادا على معدل النمو كما هو مبين في لون الوسط. في اليوم 70، قم بإعداد CDM4. استخدام CDM4 المتوسطة حتى يتم الوصول إلى العمر المطلوب من organoids.
خلال هذه الفترة، والحفاظ على لوحة على شاكر المداري تعيين في 70 دوران في الدقيقة الواحدة داخل حاضنة زراعة الأنسجة الرطبة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تغيير المتوسط كل ثلاثة إلى خمسة أيام اعتمادا على معدل النمو. إعداد حل PFA 4٪ووضعه تحت غطاء أمان.
جمع organoids الدماغ ونقلها بلطف مع حاد يميل ثلاثة ملليلتر البلاستيك باستور ماصة إلى لوحة من ستة آبار مليئة PFA. الحفاظ على organoids في محلول PFA لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. إزالة بعناية PFA مع ماصة البلاستيك باستور ثلاثة ملليلتر وغسل organoids ثابتة ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني.
تخزين organoids ثابتة في أربع درجات مئوية في برنامج تلفزيوني حتى مزيد من الاستخدام. تحتوي الأجهزة العضوية المتولدة باستخدام هذا البروتوكول على خلايا عصبية ناضجة يمكن تصورها باستخدام علامات البروتين المحددة للمعابر والتشعبات. الأجهزة العضوية الناضجة تحتوي ليس فقط على خلايا عصبية، ولكن أيضا خلايا الدبقية.
باستخدام تحليل الأعضاء الدماغ شرائح، فمن الممكن لرصد المحاور الإيجابية SMI 312 وDENDRITES MAP2 إيجابية أو الخلايا الدبقية بيتا S100. علاوة على ذلك، تساعد الصور confocal للتحقيق في توزيع مفصل وتنظيم السجود العصبية الإيجابية SOX2 فيما يتعلق بيتا-3 الخلايا العصبية إيجابية توبولين. كانت الأعضاء الدماغية ملطخة بعلامات خاصة بالميتوكوندريا ، مثل الغشاء الخارجي أو TOM20.
تم إجراء التنميط الحيوي للأعضاء العضوية في الدماغ عن طريق قياس كل من عمليات التمثيل الغذائي الميتوكوندريا باستخدام معدل استهلاك الأكسجين ، أو OCR ، والتمثيل الغذائي الجليكوليك باستخدام معدل الحموضة خارج الخلية ، أو ECAR. Oligomycin يسبب انخفاض في ملف تعريف التعرف الضوئي على الحروف، وبالتالي يحدد OCR اللازمة لإنتاج ATP. عند علاج أوليغومايسين، قد يكون هناك أيضا زيادة تعويضية في ECAR مما يشير إلى أن الخلايا يمكن أن upregulate تحلل لمنع الإجهاد الأيضي.
عند نقل الغلاف العصبي من لوحة 96 جيدا إلى لوحة الثقافة أو أثناء إجراء التثبيت ، من المهم التعامل مع الأجهزة العضوية بلطف لتجنب إتلافها. بعد توليد أعضاء الدماغ ، فإن صفيف الأقطاب الكهربائية المتعددة أو تصوير الكالسيوم سيكون طرقا مثالية لاختبار وظائف organoids.
