هذه الطريقة هي أداة للتحقيق في الآليات المشاركة في إطلاق CGRP من نظام الأوعية الدموية الثلاثي التوائم. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي القدرة على تقسيم نظام الأوعية الدموية ثلاثي التوائم إلى ثلاثة مواقع مختلفة وتقييم إطلاق CGRP داخل كل موقع متميز. سأكون أنا وإنغر يانسن أوليسن ، أحد كبار العلماء من مجموعتنا.
للبدء ، قم بإعداد أنسجة الفئران عن طريق إزالة الجلد والعضلات حول الرأس والرقبة باستخدام المقص. بعد ذلك ، استخدم أداة تشذيب العظام ومقصا لفصل الفكين السفليين عن الرأس. الآن فضح الحبل الشوكي وجذع الدماغ عن طريق إدخال أداة تشذيب العظام ذيليا في الجزء الظهري من الفقرات وإزالتها.
ثم قطع الجزء الذيلي من الجمجمة من حدود العظام القذالية وبين الجدارية لإزالة هذه الهياكل العظمية ، وفضح المخيخ. لعزل TNC الذي يعمل ذيليا على بعد حوالي 13 إلى 16 ملم من bregma على كل جانب ، قم بقطع الجزء الظهري الجانبي من جذع الدماغ بمقص زنبركي. ويتبع ذلك غمر الجانب الأيسر والأيمن من TNC في SIF.
بعد ذلك ، قم بقص الرأس في منتصف السهمي لتقسيم الجمجمة إلى قسمين باستخدام المنشار. الآن قم بإزالة الدماغ بعناية دون لمس الأم الجافية المرفقة بالجمجمة باستخدام ملعقة. لعزل TG ، قم بقصه بما في ذلك فروعه حول الحدود البصرية مع دخول فرع الفك السفلي إلى الثقبة البيضوية وفروع العيون والفك العلوي التي تدخل الجمجمة.
ثم اغمر نصفي الجمجمة و TGs في SIF. لتحضير أنسجة الفأر ، قم بإزالة الجلد والعضلات حول الرأس والرقبة باستخدام المقص. الآن فضح الحبل الشوكي وجذع الدماغ عن طريق إدخال زوج من المقصات ذيلية في الجزء الظهري من الفقرات وإزالته.
ثم قطع الجزء الذيلي من الجمجمة من حدود العظام القذالية والجبارية لإزالة هذه الهياكل العظمية التي تكشف المخيخ. قطع العظم الجداري منتصف السهمي وإزالة العظم لفضح المخ. قم بإزالة المخيخ بعناية لكشف جذع الدماغ باستخدام ملعقة.
اعزل TNC الذي يحتوي على جزء من جذع الدماغ بمقص زنبركي ، متبوعا بغمر جذع الدماغ في SIF. الآن قم بإزالة الدماغ بعناية باستخدام ملعقة وقطع العصب الثلاثي التوائم حيث يدخل جذع الدماغ. لعزل TG ، قم بقصه بما في ذلك فروعه حول الحدود البصرية مع فرع الفك السفلي حيث يدخل الثقبة البيضوية وفروع العيون والفك العلوي التي تدخل الجمجمة.
بعد ذلك ، اغمر TGs في SIF. لسهولة استبدال SIF ، أضف غطاء رسوم إلى الحاويات البلاستيكية وابدأ في غسل مناديل الفئران والفأر في SIF لمدة 30 دقيقة عن طريق استبدال SIF كل خمس دقائق. بعد 30 دقيقة من الغسيل في درجة حرارة الغرفة ، قم بنقل أنصاف الفئران عبر الوطنية و TGs الفئران لفصل أغطية أنابيب الطرد المركزي الدقيقة مع 350 ميكرولتر من SIF.
انقل جذع دماغ الفأر باستخدام TNC إلى غطاء أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 250 ميكرولتر من SIF. أخيرا ، انقل اثنين من TGs الماوس إلى غطاء أنبوب الطرد المركزي الدقيق مع 250 ميكرولتر من SIF. ضع نصفي جمجمة الفئران على صفيحة استزراع من ستة آبار واملأ الجمجمة ب 400 ميكرولتر من SIF.
ضع جماجم الفئران في أغطية أنابيب الطرد المركزي الدقيقة مع أنسجة الفئران والفئران في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية. استبدل SIF باستخدام ماصة كل خمس دقائق لمدة 20 دقيقة دون لمس المنديل. قم بإعداد أنابيب الطرد المركزي الدقيقة لجمع العينات عن طريق وضع العلامات المناسبة.
ثم أضف 50 ميكرولتر من 10 قوة عازلة EIA إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول مركب الاختبار ومحلول السيارة عن طريق التخفيف في SIF لجميع التركيزات. بعد الغسيل الأخير ، أضف 250 ميكرولتر من SIF إلى الماوس TG و TNC ، و 350 ميكرولتر SIF إلى الفئران TG و TNC ، و 400 ميكرولتر SIF لكل جمجمة فئران.
بعد 10 دقائق من الحضانة ، اجمع 200 ميكرولتر من العينة في أنبوب طرد مركزي دقيق المسمى مسبقا مع 50 ميكرولتر من 10 قوة عازلة EIA لتمكين قياس إطلاق CGRP القاعدي. تخلص من السائل المتبقي وقم بتخزين العينات على الفور عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. أضف مركب الاختبار في السيارة المقابلة بتركيزات متزايدة ، بدءا من أقل تركيز ، واحتضانه لمدة 10 دقائق.
بعد 10 دقائق من الحضانة ، اجمع 200 ميكرولتر من العينة في أنبوب طرد مركزي دقيق المسمى مسبقا مع 50 ميكرولتر من 10 قوة عازلة EIA. تخلص من السائل المتبقي وأضف ثاني أقل تركيز إلى الأنسجة. قم بتخزين العينات على الفور عند 20 درجة مئوية تحت الصفر وكرر هذا الإجراء مع التركيز المتبقي.
لإجراء تحكم إيجابي للتجربة ، أضف عنصر التحكم الإيجابي إلى الأنسجة في نهاية البروتوكول. بعد فترة حضانة مدتها 10 دقائق ، اجمع عينة 200 ميكرولتر في أنبوب طرد مركزي دقيق مع 50 ميكرولتر من 10 قوة عازلة EIA. يتم قياس تركيزات CGRP المنبعثة في العينات المجمعة باستخدام مجموعة تقييم الأثر البيئي مع اتباع تعليمات الشركة المصنعة المرفقة مع مجموعة تقييم الأثر البيئي.
في الفئران ، تسبب التعرض للكبخاخات في إطلاق CGRP كبير من الأم الجافية و TG مقارنة بالمركبة. في الأم الجافية ، تم العثور على الحد الأقصى لإطلاق CGRP في ميكرومولار واحد من كبخاخات. وفي TG ، تم العثور على الحد الأقصى لإطلاق CGRP عند 10 ميكرومولار من كبخاخات.
عند تحليلها باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه ، لا يظهر غليبينكلاميد أي تأثير على إطلاق CGRP القاعدي من الأم الجافية و TG. قلل Glibenclamide بشكل كبير من إطلاق CGRP الناجم عن الكابسيسين في الأم الجافية بنسبة 40٪ و TG بنسبة 39٪ مقارنة بالكابسيسين مع السيارة عند تحليلها باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه. تم العثور على ناهض مستقبلات عابرة محتملة Ankyrin-1 super cinnamaldehyde لإطلاق CGRP بطريقة تعتمد على التركيز من TG مع 1 و 10 و 100 ميكرومولار من سوبر سينامالدهيد مما أدى إلى زيادة إطلاق 9٪ 52٪ و 69٪ من CGRP مقارنة بالمركبة على التوالي عند تحليلها باستخدام ANOVA ثنائي الاتجاه. كان الإطلاق المتزايد ل CGRP غائبا في TG من فئران الضربة القاضية المحتملة لمستقبلات Ankyrin-1 العابرة حيث تعرض 1 و 10 و 100 ميكرومولار من سوبر سينامالدهيد مما أدى إلى تغيير بنسبة 11٪ ناقص 13٪ و 9٪ في إطلاق CGRP مقارنة بالمركبة على التوالي عند تحليلها باستخدام ANOVA ثنائي الاتجاه.
من المهم الحرص على عدم لمس الأنسجة أثناء جمع العينات وأن تكون دقيقا عند توقيت وقت الحضانة لجميع العينات. في حالة توفر مجموعات ELISA كافية ، فمن الممكن تطبيق هذا الإجراء لقياس إطلاق الببتيدات الأخرى الموجودة في نظام الأوعية الدموية ثلاثي التوائم.
