שיטה זו היא כלי לחקור מנגנונים המעורבים בשחרור CGRP ממערכת כלי הדם הטריגמינלית. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא היכולת לחלק את מערכת כלי הדם הטריגמינליים לשלושה אתרים שונים ולהעריך את שחרור ה- CGRP בתוך כל אתר נפרד. מי שמדגימים את ההליך יהיו אני ואינגר יאנסן-אולסן, מדענית בכירה מהקבוצה שלנו.
כדי להתחיל, להכין את רקמת החולדה על ידי הסרת העור ואת השריר סביב הראש והצוואר באמצעות מספריים. לאחר מכן, השתמש גוזם עצם וזוג מספריים כדי להפריד את הלסתות התחתונות מהראש. כעת חשוף את חוט השדרה ואת גזע המוח על ידי החדרת גוזם עצם לתוך החלק הגבי של החוליות והסר אותו.
לאחר מכן לחתוך את החלק caudal של הגולגולת על ידי גבולות של עצמות occipital ו interparietal כדי להסיר את מבני העצם האלה, חושף את המוח הקטן. כדי לבודד את ה-TNC הפועל כ-13 עד 16 מילימטרים מהברגמה מכל צד, חתכו את החלק הגבי של גזע המוח במספריים קפיציים. לאחר מכן טבילת TNC בצד שמאל וימין לתוך SIF.
לאחר מכן, חותכים את הראש באמצע כדי לחלק את הגולגולת לשניים באמצעות מסור. עכשיו להסיר בזהירות את המוח מבלי לגעת dura mater מחובר הגולגולת באמצעות מרית. כדי לבודד את ה- TG, חותכים אותו כולל ענפיו סביב גבולות הראייה כאשר הענף המנדיבולרי נכנס לפורמן אובלה והענפים האופטלמיים והמקסילריים נכנסים לגולגולת.
לאחר מכן לטבול את חצאי הגולגולת ואת TGs ב- SIF. כדי להכין את רקמת העכבר, הסר את העור ואת השריר סביב הראש והצוואר באמצעות מספריים. כעת חשוף את חוט השדרה ואת גזע המוח על ידי החדרת זוג מספריים באופן קאודלי לחלק הגבי של החוליות והסר אותו.
לאחר מכן לחתוך את החלק caudal של הגולגולת על ידי גבולות של עצמות occipital ו interparietal כדי להסיר את מבני העצם האלה חושפים את המוח הקטן. חותכים את עצם הקודקוד באמצע ומסירים את העצם כדי לחשוף את המוח. בזהירות להסיר את המוח הקטן כדי לחשוף את גזע המוח באמצעות מרית.
יש לבודד את ה-TNC המכיל חלק מגזע המוח באמצעות מספריים קפיציים, ולאחר מכן לטבול את גזע המוח לתוך SIF. עכשיו בזהירות להסיר את המוח באמצעות מרית לחתוך את העצב trigeminal שבו הוא נכנס לגזע המוח. כדי לבודד את ה- TG, חותכים אותו כולל ענפיו סביב גבולות הראייה עם הענף המנדיבולרי שבו הוא נכנס לענפים האופטלמיים והמקסילריים הנכנסים לגולגולת.
לאחר מכן, לטבול TGs ב- SIF. להחלפה קלה של SIF, הוסיפו מכסה אגרה למיכלי הפלסטיק והתחילו לשטוף את רקמת החולדה והעכבר ב-SIF למשך 30 דקות על ידי החלפת SIF כל חמש דקות. לאחר 30 דקות של שטיפה בטמפרטורת החדר, העבירו חצאי TNC של חולדות ו-TGs של חולדות כדי להפריד בין מכסי צינורות מיקרוצנטריפוגה עם 350 מיקרוליטרים של SIF.
העבר את גזע המוח של העכבר עם TNC למכסה צינור מיקרוצנטריפוגה עם 250 מיקרוליטר של SIF. לבסוף, העבר את שני ה- TGs של העכבר למכסה צינור מיקרוצנטריפוגה עם 250 מיקרוליטר של SIF. מניחים את חצאי גולגולת החולדה על צלחת תרבית בת שש בארות וממלאים את הגולגולת ב-400 מיקרוליטרים של SIF.
הניחו גולגולות חולדות בכובעי צינורות מיקרוצנטריפוגה עם רקמת חולדה ועכבר באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. יש להחליף את ה-SIF באמצעות פיפטה כל חמש דקות למשך 20 דקות מבלי לגעת ברקמה. הכן צינורות microcentrifuge לאיסוף דגימות על ידי תיוג מתאים.
לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטרים של 10 חוזק EIA חיץ לכל צינור microcentrifuge. לאחר מכן, הכינו את תמיסת תרכובת הבדיקה ותמיסת הרכב על ידי דילול ב-SIF לכל הריכוזים. לאחר השטיפה האחרונה, הוסיפו 250 מיקרוליטרים של SIF לעכבר TG ו-TNC, 350 מיקרוליטרים SIF לחולדות TG ו-TNC, ו-400 מיקרוליטרים SIF לכל גולגולת חולדה.
לאחר 10 דקות של דגירה, אסוף 200 מיקרוליטרים של הדגימה בצינור מיקרוצנטריפוגה מסומן מראש עם 50 מיקרוליטרים של 10 חוזק EIA כדי לאפשר מדידה של שחרור CGRP הבסיסי. יש להשליך את הנוזל הנותר ולאחסן מיד את הדגימות בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס. מוסיפים את תרכובת הבדיקה ברכב המתאים בריכוזים הולכים וגדלים, החל מהריכוז הנמוך ביותר, ודוגרים במשך 10 דקות.
לאחר 10 דקות של דגירה, לאסוף 200 microliters של הדגימה בצינור microcentrifuge מסומן מראש עם 50 microliters של 10 חוזק EIA חיץ. יש להשליך את הנוזל הנותר ולהוסיף את הריכוז השני הנמוך ביותר לרקמה. מיד לאחסן את הדגימות במינוס 20 מעלות צלזיוס ולחזור על הליך זה עם הריכוז הנותר.
כדי לבצע בקרה חיובית לניסוי, הוסף את הבקרה החיובית לרקמה בסוף הפרוטוקול. לאחר תקופת דגירה של 10 דקות, לאסוף דגימה של 200 מיקרוליטר בצינור microcentrifuge עם 50 microliters של 10 חוזק EIA חיץ. ריכוזי ה-CGRP המשתחררים בדגימות שנאספו נמדדים באמצעות ערכת EIA תוך ביצוע הוראות היצרן המצורפות לערכת EIA.
בחולדה, חשיפה לקפסאיצין גרמה לשחרור CGRP משמעותי מדורא מאטר ו-TG בהשוואה לרכב. בדורה מאטר, השחרור המרבי של CGRP נמצא במיקרומולר אחד של קפסאיצין. וב-TG, שחרור ה-CGRP המרבי נמצא ב-10 מיקרומולר של קפסאיצין.
כאשר מנתחים אותו עם ANOVA חד-כיווני, glibenclamide לא מראה השפעה על שחרור CGRP בסיסי מדורא מאטר ו-TG. גליבנקלמיד הפחית באופן משמעותי את שחרור ה-CGRP המושרה על-ידי קפסאיצין בדורה מאטר ב-40% וב-TG ב-39% בהשוואה לקפסאיצין עם הרכב כאשר ניתח אותו עם ANOVA חד-כיווני. פוטנציאל הקולטן החולף Ankyrin-1 אגוניסט סופר cinnamaldehyde נמצא לשחרר CGRP באופן תלוי ריכוז מן TG עם 1, 10, ו 100 micromolar של סופר cinnamaldehyde וכתוצאה מכך 9%52% ו 69% שחרור מוגבר של CGRP בהשוואה לרכב בהתאמה כאשר נותח עם ANOVA דו כיווני. השחרור המוגבר של CGRP נעדר ב-TG מפוטנציאל הקולטן הארעי Ankyrin-1 בעכברי נוקאאוט שבהם חשיפה ל-1, 10 ו-100 מיקרומולאר של סופר סינמלדהיד וכתוצאה מכך 11%מינוס 13% ו-9% שינוי בשחרור CGRP בהשוואה לרכב בהתאמה כאשר ניתחו אותו עם ANOVA דו-כיווני.
חשוב להיזהר שלא לגעת ברקמה במהלך איסוף הדגימה ולדייק בעת תזמון זמן הדגירה של כל הדגימות. אם קיימות ערכות ELISA מתאימות, ניתן ליישם הליך זה כדי למדוד את שחרורם של פפטידים אחרים הנמצאים במערכת כלי הדם הטריגמינלית.
