Bu yöntem, CGRP'nin trigeminal vasküler sistemden salınmasında rol oynayan mekanizmaları araştırmak için kullanılan bir araçtır. Bu yöntemin temel avantajı, trigeminal vasküler sistemi üç farklı bölgeye bölme ve CGRP'nin her bir ayrı bölgede salınımını değerlendirme yeteneğidir. Prosedürü gösterecek olan ben ve grubumuzdan kıdemli bir bilim adamı olan Inger Jansen-Olesen olacak.
Başlamak için, makas kullanarak baş ve boyun çevresindeki cildi ve kası çıkararak sıçan dokusunu hazırlayın. Daha sonra, alt çeneleri kafadan ayırmak için bir kemik düzeltici ve bir çift makas kullanın. Şimdi omuriliği ve beyin sapını, omurların dorsal kısmına kaudal olarak bir kemik düzeltici yerleştirerek ve çıkararak ortaya çıkarın.
Daha sonra kafatasının kaudal kısmını, bu kemik yapılarını çıkarmak için oksipital ve interparietal kemiklerin sınırlarından kesin ve beyinciği açığa çıkarın. TNC'yi her iki taraftaki bregmadan yaklaşık 13 ila 16 milimetre kaudal olarak izole etmek için, beyin sapının dorsolateral kısmını yaylı makasla kesin. Bunu sol ve sağ taraftaki TNC'yi SIF'ye batırmak izler.
Ardından, kafatasını testere kullanarak ikiye bölmek için kafayı orta saggitally olarak kesin. Şimdi bir spatula kullanarak kafatasına bağlı dura materine dokunmadan beyni dikkatlice çıkarın. TG'yi izole etmek için, foramen ovale giren mandibuler dal ve kafatasına giren oftalmik ve maksiller dallar ile görsel sınırların etrafındaki dallarını da dahil ederek kesin.
Ardından kafatası yarılarını ve TG'leri SIF'ye batırın. Fare dokusunu hazırlamak için, makas kullanarak baş ve boyun çevresindeki cildi ve kası çıkarın. Şimdi omuriliği ve beyin sapını, omurların sırt kısmına kaudal olarak bir çift makas sokarak ve çıkararak ortaya çıkarın.
Daha sonra, beyinciği açığa çıkaran bu kemik yapılarını çıkarmak için kafatasının kaudal kısmını oksipital ve interparietal kemiklerin sınırlarından kesin. Parietal kemiği orta saggital olarak kesin ve serebrum açığa çıkarmak için kemiği çıkarın. Bir spatula kullanarak beyin sapını ortaya çıkarmak için beyinciği dikkatlice çıkarın.
Beyin sapının bir kısmını içeren TNC'yi yaylı makasla izole edin, ardından beyin sapını SIF'ye batırın. Şimdi bir spatula kullanarak beyni dikkatlice çıkarın ve trigeminal siniri beyin sapına girdiği yerde kesin. TG'yi izole etmek için, foramen ovale girdiği mandibuler dal ve kafatasına giren oftalmik ve maksiller dallar ile görsel sınırların etrafındaki dallarını da dahil ederek kesin.
Ardından, TG'leri SIF'ye bırakın. SIF'in kolay değişimi için, plastik kaplara bir ücretli kapak ekleyin ve SIF'yi her beş dakikada bir değiştirerek sıçan ve fare dokusunu SIF'de 30 dakika boyunca yıkamaya başlayın. Oda sıcaklığında 30 dakikalık yıkamanın ardından, 350 mikrolitre SIF ile mikrosantrifüj tüp kapaklarını ayırmak için sıçan TNC yarısını ve sıçan TG'lerini aktarın.
TNC'li fare beyin sapını 250 mikrolitre SIF içeren bir mikrosantrifüj tüp kapağına aktarın. Son olarak, iki fare TG'sini 250 mikrolitre SIF içeren bir mikrosantrifüj tüp kapağına aktarın. Sıçan kafatası yarısını altı kuyucuklu bir kültür plakasına yerleştirin ve kafatasını 400 mikrolitre SIF ile doldurun.
Sıçan kafataslarını, 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir inkübatörde sıçan ve fare dokusu ile mikrosantrifüj tüp kapaklarına yerleştirin. SIF'i dokuya dokunmadan 20 dakika boyunca her beş dakikada bir pipet kullanarak değiştirin. Uygun etiketleme ile numune toplama için mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın.
Daha sonra her bir mikrosantrifüj tüpüne 50 mikrolitre 10 mukavemetli EIA tamponu ekleyin. Daha sonra, tüm konsantrasyonlar için SIF'de seyrelterek test bileşiği çözeltisini ve araç çözeltisini hazırlayın. Son yıkamayı takiben, fare TG ve TNC'ye 250 mikrolitre SIF, TG ve TNC'yi sıçanlamak için 350 mikrolitre SIF ve her sıçan kafatasına 400 mikrolitre SIF ekleyin.
10 dakikalık inkübasyondan sonra, bazal CGRP salınımının ölçülmesini sağlamak için numunenin 200 mikrolitresini 50 mikrolitre 10 mukavemetli EIA tamponu ile önceden etiketlenmiş bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın. Kalan sıvıyı atın ve numuneleri hemen eksi 20 santigrat derecede saklayın. Test bileşiğini ilgili araca artan konsantrasyonlarda, en düşük konsantrasyondan başlayarak ekleyin ve 10 dakika boyunca inkübe edin.
10 dakikalık inkübasyondan sonra, numunenin 200 mikrolitresini, 50 mikrolitre 10 mukavemetli EIA tamponu ile önceden etiketlenmiş bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın. Kalan sıvıyı atın ve dokuya ikinci en düşük konsantrasyonu ekleyin. Numuneleri hemen eksi 20 santigrat derecede saklayın ve bu prosedürü kalan konsantrasyonla tekrarlayın.
Deney için pozitif bir kontrol gerçekleştirmek için, protokolün sonunda dokuya pozitif kontrolü ekleyin. 10 dakikalık bir kuluçka süresinden sonra, 50 mikrolitre 10 mukavemetli EIA tamponu içeren bir mikrosantrifüj tüpünde 200 mikrolitrelik bir numune toplayın. Toplanan numunelerde salınan CGRP konsantrasyonları, üreticinin ÇED kiti ile birlikte verilen talimatlarına uyarak bir ÇED kiti kullanılarak ölçülür.
Sıçanda, kapsaisin maruziyeti, araca kıyasla dura mater ve TG'den önemli bir CGRP salınımına neden oldu. Dura materinde, CGRP'nin maksimum salınımı bir mikromolar kapsaisinde bulundu. TG'de, maksimum CGRP salınımı 10 mikromolar kapsaisin'de bulundu.
Tek yönlü ANOVA ile analiz edildiğinde, glibenklamid, dura mater ve TG'den bazal CGRP salınımı üzerinde hiçbir etki göstermez. Glibenklamid, tek yönlü bir ANOVA ile analiz edildiğinde, dura mater'de kapsaisin kaynaklı CGRP salınımını% 40 ve TG'de% 39 oranında önemli ölçüde azaltmıştır. Geçici reseptör potansiyeli Ankirin-1 agonisti süper sinnamaldehitin, iki yönlü ANOVA ile analiz edildiğinde araca kıyasla sırasıyla% 9% 52 ve% 69 artmış CGRP salınımı ile sonuçlanan 1, 10 ve 100 mikromolar süper sinnamaldehit ile TG'den konsantrasyona bağımlı bir şekilde CGRP salınımı yaptığı bulunmuştur. CGRP'nin artmış salınımı TG'de, geçici reseptör potansiyeli Ankyrin-1 nakavt farelerinde yoktu, burada 1, 10 ve 100 mikromolar süper sinnamaldehitin maruz kalması, iki yönlü ANOVA ile analiz edildiğinde araca kıyasla CGRP salınımında sırasıyla% 11 eksi% 13 ve% 9 değişikliğe neden oldu.
Numune toplama sırasında dokuya dokunmamaya dikkat etmek ve tüm numuneler için kuluçka süresini zamanlarken hassas olmak önemlidir. Yeterli ELISA kitleri mevcutsa, trigeminal vasküler sistemde bulunan diğer peptitlerin salınımını ölçmek için bu prosedürü uygulamak mümkündür.
