Este método é uma ferramenta para investigar mecanismos envolvidos na liberação de CGRP do sistema vascular do trigêmeo. A principal vantagem deste método é a capacidade de dividir o sistema vascular do trigêmeo em três locais diferentes e avaliar a liberação do CGRP dentro de cada local distinto. Demonstrando o procedimento estaremos eu e Inger Jansen-Olesen, cientista sênior do nosso grupo.
Para começar, prepare o tecido do rato removendo a pele e o músculo ao redor da cabeça e pescoço usando uma tesoura. Em seguida, use um aparador de ossos e uma tesoura para separar as mandíbulas inferiores da cabeça. Agora exponha a medula espinhal e o tronco encefálico inserindo um aparador de ossos caudalmente na parte dorsal das vértebras e remova-o.
Em seguida, corte a parte caudal do crânio pelas bordas dos ossos occipital e interparietal para remover essas estruturas ósseas, expondo o cerebelo. Para isolar o TNC correndo caudalmente aproximadamente 13 a 16 milímetros do bregma de cada lado, corte a parte dorsolateral do tronco encefálico com uma tesoura de mola. Isso é seguido pela imersão do TNC do lado esquerdo e direito no SIF.
Em seguida, corte a cabeça no meio da flacidez para dividir o crânio em dois usando uma serra. Agora remova cuidadosamente o cérebro sem tocar na dura-máter ligada ao crânio usando uma espátula. Para isolar o TG, corte-o incluindo seus ramos ao redor das bordas visuais com o ramo mandibular entrando no forame oval e os ramos oftálmico e maxilar entrando no crânio.
Em seguida, mergulhe as metades do crânio e os TGs no SIF. Para preparar o tecido do rato, remova a pele e o músculo ao redor da cabeça e pescoço usando uma tesoura. Agora exponha a medula espinhal e o tronco encefálico inserindo um par de tesouras caudalmente na parte dorsal das vértebras e remova-a.
Em seguida, corte a parte caudal do crânio pelas bordas dos ossos occipital e interparietal para remover essas estruturas ósseas que expõem o cerebelo. Corte o osso parietal no meio da saggitally e remova o osso para expor o cérebro. Remova cuidadosamente o cerebelo para expor o tronco encefálico usando uma espátula.
Isole o TNC que contém parte do tronco encefálico com uma tesoura de mola, seguido de imersão do tronco encefálico em SIF. Agora, remova cuidadosamente o cérebro usando uma espátula e corte o nervo trigêmeo onde ele entra no tronco cerebral. Para isolar o TG, corte-o incluindo seus ramos ao redor das bordas visuais com o ramo mandibular onde entra no forame oval e ramos oftálmicos e maxilares que entram no crânio.
Em seguida, mergulhe os TGs no SIF. Para facilitar a troca de SIF, adicione uma tampa de pedágio aos recipientes de plástico e comece a lavar o tecido de rato e rato no SIF por 30 minutos, substituindo o SIF a cada cinco minutos. Após 30 minutos de lavagem à temperatura ambiente, transfira metades TNC de rato e TGs de rato para separar tampas de tubos de microcentrífuga com 350 microlitros de SIF.
Transfira o tronco encefálico do rato com TNC para uma tampa de tubo de microcentrífuga com 250 microlitros de SIF. Finalmente, transfira os dois TGs de rato para uma tampa de tubo de microcentrífuga com 250 microlitros de SIF. Coloque as metades do crânio do rato em uma placa de cultura de seis poços e encha o crânio com 400 microlitros de SIF.
Coloque crânios de ratos em tampas de tubos de microcentrífuga com tecido de rato e rato em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius. Substitua o SIF usando uma pipeta a cada cinco minutos por 20 minutos sem tocar no tecido. Preparar tubos de microcentrífuga para coleta de amostras por rotulagem apropriada.
Em seguida, adicione 50 microlitros de tampão EIA de 10 forças a cada tubo de microcentrífuga. Em seguida, preparar a solução composta de ensaio e a solução do veículo diluindo em SIF para todas as concentrações. Após a última lavagem, adicione 250 microlitros de SIF ao TG e TNC do rato, 350 microlitros SIF ao TG e TNC do rato e 400 microlitros SIF a cada crânio de rato.
Após 10 minutos de incubação, coletar 200 microlitros da amostra em um tubo de microcentrífuga pré-marcado com 50 microlitros de tampão EIA de 10 forças para permitir a medição da liberação basal de CGRP. Descarte o líquido restante e armazene imediatamente as amostras a menos 20 graus Celsius. Adicionar o composto de ensaio no veículo correspondente em concentrações crescentes, começando pela concentração mais baixa, e incubar durante 10 minutos.
Após 10 minutos de incubação, coletar 200 microlitros da amostra em um tubo de microcentrífuga pré-marcado com 50 microlitros de tampão EIA de 10 forças. Descarte o líquido restante e adicione a segunda menor concentração ao tecido. Conservar imediatamente as amostras a menos 20 graus Celsius e repetir este procedimento com a concentração restante.
Para realizar um controle positivo para o experimento, adicione o controle positivo ao tecido no final do protocolo. Após um período de incubação de 10 minutos, coletar uma amostra de 200 microlitros em um tubo de microcentrífuga com 50 microlitros de tampão EIA de 10 forças. As concentrações de CGRP liberadas nas amostras coletadas são medidas usando um kit EIA, seguindo as instruções do fabricante fornecidas com o kit EIA.
No rato, a exposição à capsaicina induziu uma libertação significativa de CGRP da dura-máter e TG em comparação com o veículo. Na dura-máter, a liberação máxima de CGRP foi encontrada em um micromolar de capsaicina. E no TG, a liberação máxima de CGRP foi encontrada em 10 micromolares de capsaicina.
Quando analisada com uma ANOVA unidirecional, a glibenclamida não mostrou efeito sobre a liberação basal de CGRP da dura-máter e TG. A glibenclamida reduziu significativamente a liberação de CGRP induzida por capsaicina na dura-máter em 40% e TG em 39% em comparação com a capsaicina com o veículo quando analisada com uma ANOVA unidirecional. Verificou-se que o potencial receptor transitório do agonista anquirina-1 super cinamaldeído libera CGRP de maneira dependente da concentração do TG com 1, 10 e 100 micromolares de super cinamaldeído, resultando em 9% 52% e 69% de aumento da liberação de CGRP em comparação com o veículo, respectivamente, quando analisado com ANOVA bidirecional. O aumento da liberação de CGRP foi ausente no TG a partir do potencial receptor transitório Ankyrin-1 knockout camundongos onde a exposição a 1, 10 e 100 micromolares de super cinamaldeído resultando em 11% menos 13% e 9% de mudança na liberação de CGRP em comparação com o veículo, respectivamente, quando analisado com ANOVA bidirecional.
É importante ter cuidado para não tocar no tecido durante a coleta de amostras e ser preciso ao cronometrar o tempo de incubação para todas as amostras. Se kits ELISA adequados estiverem disponíveis, é possível aplicar este procedimento para medir a liberação de outros peptídeos presentes no sistema vascular do trigêmeo.
