Этот протокол может быть использован для получения более глубокого понимания динамики и роли фосфопротеинов, активных во время черепно-лицевого развития млекопитающих. Этот протокол преодолевает общий барьер дефосфорилирования во время выделения белка из двух физиологически значимых контекстов, лицевых процессов мыши и культивируемых эмбриональных клеток небной мезенхимы мыши. Крайне важно быстро двигаться, сохраняя все реагенты и материалы на льду, и использовать ингибиторы фосфатазы во всех буферах лизиса для поддержания целостности фосфорилированных белков.
Для начала положите тело мыши на рассекательную доску вентральной стороной вверх и опрыскайте брюшко мыши 70% этанолом. Затем откройте брюшную полость, защемляя и поднимая кожу спереди к влагалищному отверстию прямыми щипцами Семкена. Затем разрезайте поднятую кожу на нижележащие слои с помощью хирургических ножниц с прямым лезвием под углом 45 градусов с обеих сторон, чтобы создать V-образную форму, которая распространяется на каждую боковую поверхность примерно на полпути между четырьмя конечностями и задними конечностями.
С помощью щипцов Семкена захватите один из рогов матки и срежьте хирургическими ножницами ниже яйцевода и над шейкой матки. Чтобы обеспечить полное удаление рога матки, отрежьте мезометрий, затем переведите рассеченный рог матки до 10 миллилитров гистологического PBS в 10-сантиметровой чашке Петри. Аналогично удаляют второй рог матки на противоположной стороне брюшной полости.
После этого положите на лед 10-сантиметровую чашку Петри, содержащую оба маточных рога. Под рассекающим стереомикроскопом тщательно рассекните каждый эмбрион из маточных рогов с помощью Дюмона 5 тонких щипцов. Затем медленно оттягивайте миометрий, децидууа и хорион.
Затем порвите и удалите относительно прозрачный амнион, окружающий эмбрион, и разорвите пуповину, соединяющую эмбрион с плацентой. Затем перенесите каждый рассеченный эмбрион на 2,5 миллилитра гистологии PBS в индивидуальную лунку из 12-луночной клеточной культуральной пластины на льду с помощью разрезанной пластиковой трансферной пипетки. Приготовьте три 10-сантиметровые чашки Петри, содержащие 10 миллилитров гистологии PBS, и держите их на льду для использования во вращении между эмбрионами.
Затем перенесите один эмбрион из индивидуального колодца 12-луночной клеточной культуральной пластины в одну из 10-сантиметровых чашек Петри с гистологией PBS на льду с помощью разрезанной пластиковой переносной пипетки. Под рассекающим микроскопом отделите каждый верхнечелюстной отросток от лица с помощью тонких щипцов, сначала сделав разрез на передней стороне одного верхнечелюстного отростка вдоль естественного углубления, отделяющего боковой носовой отросток в верхнечелюстном отростке. Далее разрезаем заднюю сторону верхнечелюстного отростка вдоль естественного углубления, разделяющего верхнечелюстной отросток и нижнечелюстной отросток.
Затем полностью отделите верхнечелюстной отросток, сделав вертикальный разрез от передней до задней стороны верхнечелюстного отростка на глазной стороне верхнечелюстного отростка, где естественные углубления упоминаются выше, заканчиваются. Используя девятидюймовую пипетку Пастера с двухмиллилитровой маленькой латексной колбой, перенесите рассеченную пару верхнечелюстных отростков в небольшой капле примерно из 30 микролитров гистологии PBS в меченую 35-миллиметровую чашку Петри на льду. Затем переложите пару тканей верхнечелюстного процесса в меченую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку на льду с помощью пипетки Пастера, минимизируя перенос гистологии PBS.
Кроме того, удалите все излишки гистологии PBS в 1,5-миллилитровой микроцентрифужной трубке с пипеткой Пастера. Добавьте 0,1 миллилитра ледяного буфера лизиса NP40 с ингибиторами протеазы и фосфатазы, добавленными непосредственно перед использованием на льду. Затем пипетка вверх и вниз 10 раз с помощью 200 микролитра PIPETMAN.
Затем вихрь в течение 10 секунд, а затем пипетка вверх и вниз 10 раз с помощью 200 микролитра PIPETMAN, избегая при этом образования пузырьков. Инкубируйте при четырех градусах Цельсия в течение двух часов, вращая конец за концом, используя 1,5 миллилитра или два миллилитра весла с трубчатым револьвером. Затем центрифугируйте образцы при 13 500 х г в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия и соберите супернатант в новую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку на льду с 200-миллилитровым PIPETMAN.
Во-первых, аспирируйте среду из эмбриональных клеток небной мезенхимы мыши, используя 5,75-дюймовую пипетку Пастера, прикрепленную к вакуумной системе. Затем дважды промыть клетки ледяной культурой тканей PBS и наклонить пластину в сторону во время последней промывки, чтобы убедиться, что вся культура тканей PBS аспирирована. Затем добавьте ледяной буфер лизиса NP40 с ингибиторами протеазы и фосфатазы, добавленными непосредственно перед использованием на льду для лизирования клеток.
Высиживайте пластину на льду в течение пяти минут с вращением примерно каждую минуту, чтобы обеспечить полное покрытие пластины. Затем соскоблите ячейки с пластины с помощью предварительно охлажденного подъемника и перенесите клеточную суспензию в предварительно охлажденную 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку на льду. После этого инкубируйте клеточную суспензию при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут, вращая конец над концом, используя 1,5 миллилитра или два миллилитра весла с трубчатым револьвером.
Затем центрифугируйте образцы при 13 500 х г в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия и соберите супернатант в новую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку на льду с 200-миллилитровым PIPETMAN. Западный анализ лизатов целых клеток из увековеченных эмбриональных клеток небной мезенхимы мыши после стимуляции лигандом PDFG-B от 2 до 15 минут выявил отчетливые воспроизводимые полосы для фосфопротеинов, которые работают на высоте или вблизи высоты соответствующей общей белковой полосы. Увеличение интенсивности фосфопротеинового диапазона наблюдалось при лечении фактором роста по сравнению с таковыми у необработанных клеток, в то время как общие интенсивности белковой полосы были относительно равны между образцами.
Этот протокол может быть использован для исследования того, как возмущения и фосфорилирование непосредственно влияют на межклеточную сигнализацию, экспрессию генов и клеточную активность в черепно-лицевых контекстах.
