يسمح هذا البروتوكول بتتبع و تحديد كمية تدهور البروتين من الاهتمام في العيش والشيخوخة C.elegans. هذا في تقنية vivo وغير باضع يتطلب فقط المجهر قليلاً التي أنشئت لتحويل موثوق Dendra2 إلى الفلوروف مشرق ومستقر. وهذه الطريقة قابلة للتكيف مع نظم الثدييات، وكذلك سمك الحمار الوحشي.
للدراسة، وضع في دوران داخل شبكة proteostatis، فضلا عن النقل والاتجار. الحرص على عدم إثارة التحويل غير المرغوب فيه من Dendra2 أثناء المسح الضوئي مع الليزر الضوء الأزرق، واختبار وتحسين إعدادات الاستحواذ وإعدادات التحويل لكل نظام والبروتين الانصهار. تبدأ من خلال زراعة الديدان الخيطية المطابقة للعمر عند 20 درجة مئوية إلى السن المطلوبة للتجربة.
في يوم تجربة التصوير، تذوب أغاروز الصف العام في تركيز 3٪في الماء المقطر مزدوجة. في حين أن agarose هو التبريد، وقطع غيض من طرف ماصة ملليلتر واحد لتسهيل طموح ما يقرب من 400 ميكرولترات من agarose ذاب. إضافة بعناية بضع قطرات من agarose على شريحة زجاجية نظيفة وعلى الفور وضع شريحة أخرى على رأس قطرات لإنشاء لوحة رقيقة من agarose بين القطعتين الزجاجيتين.
عندما تجفيف agarose، بعناية إزالة الشريحة العلوي. عندما تم إعداد ما يكفي من الشرائح، افتح برنامج المجهر confocal وتعيين مسار الضوء للإثارة والانبعاثات. للدندرا 2 الخضراء إضافة 486 إلى 553 نانومتر، وDendra2 الأحمر إضافة 580 إلى 740 نانومتر.
ضبط السلطة وكسب كل من القنوات وفقا لشدة الفلوروفور وتعيين الثقب لفتح تماما. حدد وضع قناة تسلسلي وقم بتعيين المسار للتبديل كل إطار. تعيين وضع المسح الضوئي كإطار وحجم الإطار 1024 في 1024 مع خط خطوة واحدة.
تعيين المتوسط إلى اثنين والمتوسط حسب الأسلوب المتوسط وطريقة خط أحادي الاتجاه. تعيين عمق بت إلى ثمانية بتات. حدد إعداد الاكتساب متعدد الأبعاد لتحويل Dendra2.
للتحويل والتبييض، استخدم 405 نانومتر ليزر الصمام الثنائي تعيين إلى 60٪ الطاقة. حدد سلسلة زمنية من دورتين بفاصل 0.0 مللي ثانية بين الدورات وبدء وإيقاف عاديين. تعيين التبييض لبدء بعد مسح واحد من اثنين، لتكرار ل30 التكرارات والتوقف عند انخفاض كثافة إلى 50٪، ثم تحديد سرعة بكسل اقتناء يسكن إلى صيام للتحويل وإلى متوسط لالتقاط صورة مبكرة.
لتركيب النيماتودا على الشرائح، استخدم علامة دائمة لرسم ورقم إطار بأربعة مربعات على عكس لوحة agarose على كل شريحة. إضافة 15 ميكرولترات من levamisole إلى منتصف لوحة agarose واستخدام مجهر ستيريو واختيار الأسلاك لنقل للنيماتودا مطابقة للعمر في قطرات. استخدام اختيار رمش لنقل بلطف كل نعمة في نافذة واحدة من مربع.
عندما تم إعادة وضع جميع الديدان الخيطية ، انتظر حتى تتوقف الديدان عن الحركة قبل وضع زلة غطاء فوق السائل لشل حركة الديدان الخيطية أثناء التصوير. ثم، ضع الشريحة على مرحلة المجهر confocal. لتحويل Dendra2 الخضراء، استخدم العدسة الهدف 20 X تحت الفلورسين الخضراء لتحديد موقع الخيطية الأولى والتركيز على الرأس أو الذيل.
التبديل إلى وضع confocal وزيادة أو إنقاص كسب وقوة الليزر للحصول على المشبعة ، ولكن ليس فوق تعريض الصورة. رسم منطقة من الاهتمام حول الخلايا العصبية المختارة ورسم منطقة أكبر ثانية من الفائدة حول الذيل الذي يتضمن المنطقة الأولى من الفائدة. تعيين المنطقة الأولى التي يتم الحصول عليها، تبييض، وتحليلها.
تعيين المنطقة الثانية من الفائدة التي سيتم الحصول عليها وتحليلها، ولكن ليس ابيض. تعيين سرعة المسح الضوئي إلى أقصى حد ممكن وبدء المسح الضوئي لتحويل الخلايا العصبية Dendra2 المحدد. مباشرة بعد التحويل، بدء المسح الحي مع ليزر خضراء 561 نانومتر لتصور Dendra2 في القناة الحمراء والعثور على التركيز وإسقاط الحد الأقصى لكل من الخلايا العصبية المحولة.
تعيين سرعة سرعة المسح الضوئي إلى أقل بكسل يسكن بسرعة والحصول على صورة لقطة من كل القنوات في دقة أعلى. تعتبر هذه الصورة في وقت الصفر بعد التحويل. ثم احفظ الفحص باستخدام اسم أو رقم قابل للتحديد، متبوعاً بتسمية الوقت صفر.
لتتبع تدهور Dendra2 مع مرور الوقت، افتح صورة مرات صفر من الخلايا العصبية الخيطية المعنية. باستخدام نفس الإعداد الصورة، بدء المسح الحي في القناة الحمراء وإحضار الخلايا العصبية الحمراء المحولة في التركيز. ثم، دون تغيير أية معلمات الاكتساب، الحصول على لقطة بنفس سرعة الصورة الأولى.
تأكد من تحديد إعداد التحويل بعناية لتحويل Dendra2 بكفاءة وكافية والحفاظ على نفس معلمات الاستحواذ في جميع أنحاء نقاط زمنية مختلفة. لتحليل الصور Dendra2 المحولة، افتح الصور الزمنية صفر ونقطة الوقت الثاني في فيجي وفتح تحليل وتعيين القياسات. حدد وظائف المنطقة والكثافة المتكاملة وحدد الصورة التي تم الحصول عليها من خلال القناة الحمراء.
باستخدام أداة تحديد المضلع، رسم منطقة من الاهتمام حول الوقت صفر تحويل الخلايا العصبية. لتحديد ملامح الخلايا العصبية بشكل صحيح، حدد صورة، ضبط، وعتبة لتسليط الضوء على عتبات كثافة. بمجرد تحديد التحديد، انقر فوق تحليل وقياس.
ستظهر نافذة نتائج منبثقة، بما في ذلك المنطقة والكثافة المدمجة وقيم الكثافة المدمجة الأولية للمنطقة التي ترغب فيها. تنفيذ نفس عملية التحديد والقياس للصورة من نقطة الوقت الثاني. ثم نسخ القيم في جدول البيانات.
في هذا التحليل التمثيلي قبل التحويل، لم تكن هناك إشارة حمراء مرئية عندما كانت العينة متحمسة في القناة الحمراء. وعند التشعيع، تضاءلت الإشارة الخضراء مع تحويل HTT-D2 وظهرت إشارة حمراء في وقت لاحق. تحطّت عبارة HTT-D2 بمرور الوقت، مما أدى إلى انخفاض في مستويات إشارة HTT-D2 الحمراء والزيادة المحتملة لإشارة HTT-D2 الخضراء حيث تم تصنيع المزيد من البروتين الاندماجي حديثًا.
وتجدر الإشارة إلى أن الخلايا العصبية في منطقة الذيل كانت مصممة لتكون أكثر نشاطا بكثير مقارنة بتلك التي من الرأس. علاوة على ذلك، كان هناك تدهور أكثر بكثير من السيطرة HTTQ25-D2 بعد 24 ساعة من التحويل، ثم بعد ساعتين في كل من الخلايا العصبية الرأس والذيل. غير أن هذا الاختلاف لم يُلاحظ في HTTQ97-D2 المسبب للأمراض، مما يشير إلى أن شبكة البروتيوستاسيس لم تتمكن من إزالة HTT-D2 التي تحتوي على امتدادات الجلوتامين الأطول في جميع أنحاء الجهاز العصبي.
HTTQ97-D2 لم تتحلل بكفاءة HTTQ25-D2 في الديدان الخيطية القديمة جدا، مما يسلط الضوء على عدم قدرة شبكة البروتيوستاسيس لإزالة الأنواع المجمعة وربما السامة من هنتتين في الحيوانات القديمة. الأهم من ذلك، كانت الخلايا العصبية التيل قادرة على التعامل مع HTTQ97-D2 السامة في الديدان الخيطية الشباب، مما يشير إلى أن مختلف آليات شبكة البروتيوستاسيس المصاحبة قد تكون في العمل لإزالة HTT-D2. للحصول على كل عينة وغير تعريض وغير المشبعة صورة مباشرة بعد التحويل وإعادة استخدام نفس الإعداد لتلك العينة على مر الزمن.
مع هذا البروتوكول، فمن الممكن لاختبار التغييرات في شبكة البروتينات، وأيضا، مع مساعدة من المجهر فائقة الدقة، لتتبع انتشار البروتينات المرتبطة بالمرض.
