حاليا لا يوجد علاج كامل لمرض التصلب المتعدد. يسمح بروتوكولنا بالبناء الفعال لنموذج التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي للمساعدة في استكشاف علاجات مرض التصلب المتعدد. الميزة الرئيسية لبروتوكولنا هي تقييم أكثر شمولا لعلاج التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي من وجهات نظر متعددة.
قم أولا بإعداد مستحلب ببتيد البروتين السكري oligodendrocyte myelin عن طريق إذابة الببتيد المجفف بالتجميد و PBS المعقم المبرد مسبقا بدون أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم عند درجة الحموضة 7.4. أضف كرة فولاذية معقمة بخمسة ملليمترات إلى أنبوب طرد مركزي صغير نظيف بسعة 2 ملليلتر. ثم أضف 500 ميكرولتر من مساعد فرويد الكامل الذي يحتوي على خمسة ملليغرام لكل ملليلتر من البكتيريا السلية المجففة بالتجميد و 500 ميكرولتر من مستحلب الببتيد البروتين السكري قليل التغصن الميالين إلى الأنبوب.
الآن تذبذب الأنبوب على lyser الأنسجة لمدة 10 دقائق. ثم قم بتبريد الأنابيب على الثلج لمدة 10 دقائق. كرر العملية أربع مرات حتى يتم تشكيل محلول لزج أبيض.
بعد ذلك ، قم بتخفيف محلول ساق توكسين السعال الديكي 50 مرة في PBS معقم من الرقم الهيدروجيني 7.4 بدون أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم لتحقيق تركيز نهائي قدره 200 نانوجرام لكل 100 ميكرولتر. لترسيب جميع مستحلب الببتيد البروتين السكري oligodendrocyte المايلين المعد في البداية في الجزء السفلي من الأنبوب ، قم بجهاز طرد مركزي للأنبوب عند أربع درجات مئوية لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان ، عن طريق الضغط على زر النبض على الجهاز. استنشاق مستحلب الببتيد البروتين السكري oligodendrocyte المايلين مع حقنة واحد ملليلتر مجهزة بإبرة قياس 22 ونقل المستحلب إلى برميل حقنة جديد 1 ملليلتر.
قم بتوصيل إبرة قياس 26 بالبرميل وقم بتأمين الاتصال بفيلم مانع للتسرب. حقن 100 ميكرولتر من مستحلب الببتيد البروتين السكري oligodendrocyte المايلين تحت الجلد على كل جانب من العمود الفقري الظهري للفأر. بعد الحقن ، لاحظ التكوين التلقائي للكتل المنتفخة تحت الجلد والظهر.
ثم داخل الصفاق ، حقن 100 ميكرولتر من سم السعال الديكي في نفس الماوس. قم بإعداد غرفة تفاعل المجال المفتوح وقم بإعداد نظام تحليل الفيديو لتسجيل حركة الماوس. لتنظيف غرفة التفاعل قبل التجربة ، قم برش 70٪ من الإيثانول على المنطقة بأكملها وامسحها بمنشفة ورقية نظيفة.
بعد ذلك ضع الماوس في زاوية غرفة التفاعل. لبدء التصوير ، انقر فوق زر بدء الالتقاط في شريط القائمة بنظام تسجيل الفيديو وسجل الوقت. الحفاظ على الصمت في غرفة الاختبار ، دع الماوس يتحرك بحرية لمدة خمس دقائق.
ثم أوقف التسجيل واحفظ الفيديو. ضع الماوس مرة أخرى في قفصه. ثم قم بتنظيف منطقة الاختبار باستخدام 70٪ إيثانول وانتقل إلى الماوس التالي.
حافظ على الماوس الرحيم مسطحا على صينية تشريح وإصلاح الأطراف. امسك جلد الطرف الخلفي في الماوس بالملقط وافتح الجلد والعضلات بالمقص. بعد ذلك ، افصل عظم الفخذ عن الساق وعظم الورك باستخدام المقص بعناية.
إزالة العضلات الملتصقة بعظم الفخذ بالمقص. ثم ضع عظم الفخذ في 70٪ إيثانول في درجة حرارة الغرفة. في هذه الدراسة ، تم تقييم قدرة الببتيد المشتق من البروتين السكري قليل التغصن الميالين على تحفيز EAE.
شهدت الفئران المحقونة بالببتيد فقدان الوزن التدريجي. بعد ستة إلى تسعة أيام من الحقن ، ظهرت عليهم أعراض EAE التي بلغت ذروتها بعد 14 إلى 16 يوما. أظهرت مخططات المسار من اختبار المجال المفتوح أن EAE يغير السلوك الاستكشافي الطبيعي للفئران.
بالمقارنة مع الفئران العادية ، سافرت الفئران مع EAE مسافة أقل بكثير في مراحل البداية المبكرة والذروة والمغفرة. كما أن الفئران المصابة ب EAE قد خفضت بشكل كبير مدة النشاط في مرحلتي الذروة والمغفرة للمرض. علاوة على ذلك ، في جميع المراحل الثلاث ، كان لدى فئران EAE مسافة سفر أقل بكثير والوقت الذي تقضيه في المركز.
كشفت فحوصات التصوير المقطعي المحوسب الدقيق لعظم الفخذ من فئران EAE عن بنية تربيقية مختلفة عن الفئران العادية. كان لدى عظم الفخذ من فئران EAE كثافة معدنية أقل بكثير في العظام ونسبة حجم العظام إلى حجم الأنسجة من تلك الموجودة في الفئران العادية. علاوة على ذلك ، كان لعظم الفخذ من الفئران المصابة ب EAE كثافة اتصال تربيقي أقل ، وعدد تربيقي ، وسمك تربيقي من تلك الموجودة في الفئران العادية.
بالمقارنة مع الفئران العادية ، تم تعزيز التباعد التربيقي وتقليل سمك العظام القشرية في الفئران EAE. يمكننا أيضا عزل الدماغ ورمز العمود الفقري لفئران EAE في ذروة المرض وتحليل إنتاج الخلايا المناعية والسيتوكينات عن طريق قياس خلايا الإنفلونزا.
