Derzeit gibt es keine vollständige Heilung für Multiple Sklerose. Unser Protokoll ermöglicht die effektive Konstruktion eines experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis-Modells, um die Erforschung von Therapien für Multiple Sklerose zu unterstützen. Der Hauptvorteil unseres Protokolls ist eine umfassendere Bewertung der Behandlung der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis aus mehreren Perspektiven.
Bereiten Sie zunächst eine Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein-Peptidemulsion her, indem lyophilisiertes Peptid und steriles vorgekühltes PBS ohne Calcium- und Magnesiumionen bei pH 7,4 gelöst werden. Fügen Sie eine sterilisierte Fünf-Millimeter-Stahlkugel in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen mit zwei Millilitern hinzu. Dann fügen Sie 500 Mikroliter des kompletten Freuds-Adjuvans mit fünf Milligramm pro Milliliter lyophilisiertem Mikrobakterium tuberculosis und 500 Mikroliter der Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein-Peptidemulsion in die Röhre hinzu.
Schwingen Sie nun die Röhre auf einem Gewebelyseur für 10 Minuten. Anschließend kühlen Sie die Röhrchen 10 Minuten auf Eis. Wiederholen Sie den Vorgang viermal, bis sich eine weißviskose Lösung bildet.
Als nächstes verdünnen Sie die Pertussis-Toxin-Stiellösung 50-mal in sterilem PBS von pH 7,4 ohne Calcium- und Magnesiumionen, um eine Endkonzentration von 200 Nanogramm pro 100 Mikroliter zu erreichen. Um die gesamte anfänglich hergestellte Myelin-Oligodendrozyten-Glykoproteinpeptidemulsion am Boden des Röhrchens auszufällen, zentrifugieren Sie das Röhrchen bei vier Grad Celsius für zwei bis drei Sekunden, indem Sie die Impulstaste am Gerät drücken. Die Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein-Peptidemulsion wird mit einer Ein-Milliliter-Spritze abgesaugt, die mit einer 22-Gauge-Nadel ausgestattet ist, und die Emulsion in einen neuen 1-Milliliter-Spritzenzylinder überführt.
Befestigen Sie eine 26-Gauge-Nadel am Lauf und sichern Sie die Verbindung mit einer Dichtungsfolie. Injizieren Sie 100 Mikroliter der Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein-Peptidemulsion subkutan auf jede Seite der Rückenwirbelsäule einer Maus. Beobachten Sie nach der Injektion die automatische Bildung von bauchigen Massen unter der Haut und dem Rücken.
Dann intraperitoneal injizieren Sie 100 Mikroliter Pertussis-Toxin in dieselbe Maus. Bereiten Sie eine Reaktionskammer im offenen Feld vor und richten Sie ein Videoanalysesystem zur Aufzeichnung der Fortbewegung von Mäusen ein. Um die Reaktionskammer vor dem Experiment zu reinigen, sprühen Sie 70% Ethanol auf die gesamte Fläche und wischen Sie mit einem sauberen Papiertuch ab.
Als nächstes platzieren Sie eine Maus in der Ecke einer Reaktionskammer. Um mit der Aufnahme zu beginnen, klicken Sie auf die Schaltfläche Aufnahme starten in der Menüleiste des Videoaufzeichnungssystems und notieren Sie die Zeit. Halten Sie Stille im Testraum und lassen Sie die Maus fünf Minuten lang frei bewegen.
Stoppen Sie dann die Aufnahme und speichern Sie das Video. Setzen Sie die Maus wieder in ihren Käfig. Reinigen Sie dann den Testbereich mit 70% Ethanol und fahren Sie mit der nächsten Maus fort.
Halten Sie die eingeschläferte Maus flach auf einem Seziertablett und fixieren Sie die Extremitäten. Halten Sie die Hintergliedmaßenhaut mit einer Pinzette in der Maus und öffnen Sie die Haut und Muskeln mit einer Schere. Als nächstes trennen Sie den Femur von der Tibia und dem Hüftknochen, indem Sie vorsichtig die Schere benutzen.
Entfernen Sie die Muskeln, die am Oberschenkelknochen haften, mit einer Schere. Dann legen Sie den Femur in 70% Ethanol bei Raumtemperatur. In dieser Studie wurde die Fähigkeit von Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein-abgeleiteten Peptiden, EAE zu induzieren, bewertet.
Mäuse, denen das Peptid injiziert wurde, erlebten einen fortschreitenden Gewichtsverlust. Nach sechs bis neun Tagen Injektion entwickelten sie EAE-Symptome, die nach 14 bis 16 Tagen ihren Höhepunkt erreichten. Trackplots aus dem Freilandtest zeigten, dass EAE das normale explorative Verhalten von Mäusen verändert.
Im Vergleich zu normalen Mäusen legten die Mäuse mit EAE in den frühen Beginn-, Spitzen- und Remissionsphasen signifikant weniger Strecken zurück. Mäuse mit EAE hatten auch eine signifikant reduzierte Aktivitätsdauer in den Spitzen- und Remissionsphasen der Krankheit. Darüber hinaus hatten die EAE-Mäuse in allen drei Phasen signifikant weniger Reisedistanz und Zeit, die sie im Zentrum verbrachten.
Mikrocomputertomographie-Scans von Oberschenkelknochen von EAE-Mäusen zeigten eine trabekuläre Architektur, die sich von normalen Mäusen unterscheidet. Femuren von EAE-Mäusen hatten signifikant weniger Knochenmineraldichte und Knochenvolumen zu Gewebevolumen als die von normalen Mäusen. Darüber hinaus hatten Femuren von Mäusen mit EAE eine geringere trabekuläre Verbindungsdichte, Trabekelzahl und Trabekulardicke als die von normalen Mäusen.
Im Vergleich zu normalen Mäusen wurde der trabekuläre Abstand bei EAE-Mäusen vergrößert und die kortikale Knochendicke reduziert. Wir können auch den Gehirn- und Wirbelsäulencode von EAE-Mäusen auf dem Höhepunkt der Krankheit isolieren und die Produktion von Immunzellen und Zytokinen durch Grippezytometrie analysieren.
