Attualmente non esiste una cura completa per la sclerosi multipla. Il nostro protocollo consente la costruzione efficace di un modello sperimentale di encefalomielite autoimmune per aiutare a esplorare le terapie per la malattia della sclerosi multipla. Il vantaggio principale del nostro protocollo è una valutazione più completa del trattamento dell'encefalomielite autoimmune sperimentale da molteplici prospettive.
Per prima cosa preparare l'emulsione peptidica glicoproteina oligodendrocitaria della mielina sciogliendo il peptide liofilizzato e il PBS pre-raffreddato sterile senza ioni calcio e magnesio a pH 7,4. Aggiungere una sfera d'acciaio sterilizzata da cinque millimetri a un micro tubo di centrifuga pulito da due millilitri. Quindi aggiungere 500 microlitri di adiuvante completo di Freuds contenente cinque milligrammi per millilitro di microbatterio tuberculosis liofilizzato e 500 microlitri di emulsione peptidica glicoproteina oligodendrocitaria mielina al tubo.
Ora fai oscillare il tubo su un lyser tissutale per 10 minuti. Quindi raffreddare i tubi sul ghiaccio per 10 minuti. Ripetere il processo quattro volte fino a formare una soluzione viscosa bianca.
Quindi, diluire la soluzione di gambo della tossina della pertosse 50 volte in PBS sterile di pH 7,4 senza ioni di calcio e magnesio per ottenere una concentrazione finale di 200 nanogrammi per 100 microlitri. Per precipitare tutta l'emulsione peptidica di glicoproteina oligodendrocitaria mielinica inizialmente preparata sul fondo del tubo, centrifugare il tubo a quattro gradi Celsius per due o tre secondi, premendo il pulsante dell'impulso sull'apparecchiatura. Aspirare l'emulsione peptidica glicoproteina oligodendrocitaria mielinica con una siringa da un millilitro dotata di un ago da 22 gauge e trasferire l'emulsione in un nuovo cilindro di siringa da 1 millilitro.
Attaccare un ago calibro 26 alla canna e fissare la connessione con una pellicola sigillante. Iniettare 100 microlitri di emulsione peptidica glicoproteina oligodendrocitaria mielinica per via sottocutanea su ciascun lato della spina dorsale di un topo. Dopo l'iniezione, osservare la formazione automatica di masse bulbose sotto la pelle e il dorso.
Quindi per via intraperitoneale, iniettare 100 microlitri di tossina della pertosse nello stesso topo. Preparare una camera di reazione in campo aperto e impostare un sistema di analisi video per la registrazione della locomozione del topo. Per pulire la camera di reazione prima dell'esperimento, spruzzare il 70% di etanolo su tutta l'area e pulire con un tovagliolo di carta pulito.
Quindi posiziona un mouse nell'angolo di una camera di reazione. Per iniziare le riprese, fare clic sul pulsante di avvio acquisizione nella barra dei menu del sistema di registrazione video e registrare l'ora. Mantenendo il silenzio nella stanza di prova, lascia che il mouse si muova liberamente per cinque minuti.
Quindi interrompere la registrazione e salvare il video. Rimetti il mouse nella sua gabbia. Quindi pulire l'area di prova con etanolo al 70% e procedere al mouse successivo.
Tenere il topo eutanasia piatto su un vassoio da dissezione e fissare le estremità. Tenere la pelle degli arti posteriori nel mouse con una pinza e aprire la pelle e i muscoli con le forbici. Quindi, separare il femore dalla tibia e dall'osso dell'anca usando attentamente le forbici.
Rimuovere i muscoli aderenti al femore con le forbici. Quindi posizionare il femore in etanolo al 70% a temperatura ambiente. In questo studio, è stata valutata la capacità del peptide derivato dalla glicoproteina oligodendrocitaria della mielina di indurre EAE.
I topi iniettati con il peptide hanno sperimentato una progressiva perdita di peso. Dopo sei-nove giorni di iniezione, hanno sviluppato sintomi EAE che hanno raggiunto il picco dopo 14-16 giorni. I grafici delle tracce del test in campo aperto hanno dimostrato che EAE altera il normale comportamento esplorativo dei topi.
Rispetto ai topi normali, i topi con EAE hanno percorso una distanza significativamente inferiore nelle fasi di esordio precoce, picco e remissione. I topi con EAE avevano anche una durata dell'attività significativamente ridotta nelle fasi di picco e remissione della malattia. Inoltre, in tutte e tre le fasi i topi EAE avevano significativamente meno distanza di viaggio e tempo trascorso al centro.
Le scansioni di tomografia microcomputerizzata di femori di topi EAE hanno rivelato un'architettura trabecolare diversa dai topi normali. I femori dei topi EAE avevano significativamente meno densità minerale ossea e volume osseo al volume del volume tissutale rispetto a quelli dei topi normali. Inoltre, i femori di topi con EAE avevano meno densità di connessione trabecolare, numero trabecolare e spessore trabecolare rispetto a quelli dei topi normali.
Rispetto ai topi normali, la spaziatura trabecolare è stata migliorata e lo spessore osseo corticale è stato ridotto nei topi EAE. Possiamo anche isolare il cervello e il codice spinale dei topi EAE al culmine della malattia e analizzare la produzione di cellule immunitarie e citochine mediante citometria influenzale.
