現在、多発性硬化症の完全な治療法はありません。私たちのプロトコルは、多発性硬化症の治療法を探求するのに役立つ実験的自己免疫性脳脊髄炎モデルの効果的な構築を可能にします。私たちのプロトコルの主な利点は、実験的自己免疫性脳脊髄炎の治療をより包括的に評価することです 複数の視点から。
まずpH7.4でカルシウムイオンおよびマグネシウムイオンを含まない凍結乾燥ペプチドおよび滅菌予冷PBSを溶解することによりミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチドエマルジョンを調製する。清潔な2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに滅菌された5ミリメートルの鋼球を1つ追加します。次に、凍結乾燥結核菌1ミリリットルあたり5ミリグラムおよび500マイクロリットルのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチドエマルジョンを含む500マイクロリットルの完全なフロイトアジュバントをチューブに加えます。
次に、ティッシュライザーでチューブを10分間振動させます。次に、チューブを氷上で10分間冷却します。白色粘性溶液が形成されるまでこのプロセスを4回繰り返します。
次に、百日咳毒素の茎溶液をカルシウムイオンとマグネシウムイオンを含まないpH 7.4の滅菌PBSで50倍に希釈して、100マイクロリットルあたり200ナノグラムの最終濃度を達成します。最初に調製したミエリン希突起膠細胞糖タンパク質ペプチドエマルジョンをすべてチューブの底部に沈殿させるには、装置のパルスボタンを押して、チューブを摂氏4度で2〜3秒間遠心分離します。ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチドエマルジョンを22ゲージの針を備えた1ミリリットルのシリンジで吸引し、エマルジョンを新しい1ミリリットルのシリンジバレルに移します。
26ゲージの針をバレルに取り付け、シーリングフィルムで接続を固定します。100マイクロリットルのミエリン希突起膠細胞糖タンパク質ペプチドエマルジョンをマウスの背背脊椎の両側に皮下注射する。注射後、皮膚と背部の下に球根状の腫瘤が自動的に形成されるのを観察します。
次に腹腔内に、100マイクロリットルの百日咳毒素を同じマウスに注射します。オープンフィールド反応チャンバーを準備し、マウスの移動を記録するためのビデオ分析システムをセットアップします。実験前に反応室を洗浄するには、70%エタノールを全体にスプレーし、清潔なペーパータオルで拭きます。
次に、反応室の隅にマウスを置きます。撮影を開始するには、ビデオ録画システムのメニューバーにある[キャプチャの開始]ボタンをクリックして、時間を記録します。テストルームで沈黙を保ちながら、マウスを5分間自由に動かします。
次に、録画を停止してビデオを保存します。マウスをケージに戻します。次に、70%エタノールでテスト領域を洗浄し、次のマウスに進みます。
安楽死させたマウスを解剖トレイに平らに保ち、四肢を固定します。マウスの後肢の皮膚を鉗子で保持し、ハサミで皮膚と筋肉を開きます。次に、ハサミを慎重に使用して、大腿骨を脛骨と腰の骨から分離します。
大腿骨に付着している筋肉をハサミで取り除きます。次に、大腿骨を室温の70%エタノールに入れます。この研究では、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質由来ペプチドがEAEを誘導する能力を評価しました。
ペプチドを注射したマウスは、進行性の体重減少を経験した。注射の6〜9日後、彼らは14〜16日後にピークに達するEAE症状を発症しました。オープンフィールドテストのトラックプロットは、EAEがマウスの通常の探索行動を変えることを示しました。
正常なマウスと比較して、EAEを有するマウスは、初期発症、ピーク、および寛解期に有意に短い距離を移動した。EAEを有するマウスはまた、疾患のピーク期および寛解期における活動持続時間が大幅に減少した。さらに、3つのフェーズすべてにおいて、EAEマウスの移動距離と中心で過ごす時間が有意に少なかった。
EAEマウスの大腿骨のマイクロコンピューター断層撮影スキャンは、通常のマウスとは異なる小柱構造を明らかにしました。EAEマウスの大腿骨は、正常マウスのものよりも骨塩密度と骨体積対組織体積比が有意に少なかった。さらに、EAEマウスの大腿骨は、正常マウスよりも線維柱帯接続密度、骨梁数、および骨梁の厚さが少なかった。
正常マウスと比較して、EAEマウスでは線維柱帯が拡大し、皮質骨の厚さが減少しました。また、疾患ピーク時のEAEマウスの脳および脊髄コードを分離し、インフルエンザサイトメトリーによって免疫細胞およびサイトカインの産生を解析することもできます。
