Atualmente não há cura completa para a esclerose múltipla. Nosso protocolo permite a construção efetiva de um modelo experimental de encefalomielite autoimune para ajudar a explorar terapias para a doença da esclerose múltipla. A principal vantagem do nosso protocolo é uma avaliação mais abrangente do tratamento da encefalomielite autoimune experimental a partir de múltiplas perspectivas.
Primeiro, prepare a emulsão de peptídeo glicoproteína oligodendrócitos de mielina dissolvendo peptídeo liofilizado e PBS estéril pré-resfriado sem íons cálcio e magnésio em pH 7,4. Adicione uma esfera de aço esterilizada de cinco milímetros a um tubo de microcentrífuga limpo de dois mililitros. Em seguida, adicione 500 microlitros de adjuvante completo de Freuds contendo cinco miligramas por mililitro de microbactéria liofilizada tuberculose e 500 microlitros da emulsão de peptídeo glicoproteína oligodendrócitos de mielina ao tubo.
Agora oscile o tubo em um lisador de tecido por 10 minutos. Em seguida, esfrie os tubos no gelo por 10 minutos. Repita o processo quatro vezes até que uma solução viscosa branca seja formada.
Em seguida, dilua a solução de caule de toxina pertussis 50 vezes em PBS estéril de pH 7,4 sem íons cálcio e magnésio para atingir uma concentração final de 200 nanogramas por 100 microlitros. Para precipitar toda a emulsão de peptídeo glicoproteico de oligodendrócitos de mielina inicialmente preparada no fundo do tubo, centrifugar o tubo a quatro graus Celsius por dois a três segundos, pressionando o botão de pulso no equipamento. Aspirar a emulsão de peptídeo glicoproteína oligodendrócitos de mielina com uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 22 e transferir a emulsão para um novo barril de seringa de 1 mililitro.
Fixe uma agulha de calibre 26 ao cano e prenda a conexão com um filme de vedação. Injete 100 microlitros da emulsão de peptídeo glicoproteína oligodendrócitos de mielina por via subcutânea em cada lado da coluna dorsal de um rato. Após a injeção, observe a formação automática de massas bulbosas sob a pele e o dorso.
Em seguida, por via intraperitoneal, injete 100 microlitros de toxina pertussis no mesmo rato. Prepare uma câmara de reação de campo aberto e configure um sistema de análise de vídeo para registrar a locomoção do rato. Para limpar a câmara de reação antes do experimento, borrife etanol a 70% em toda a área e limpe com uma toalha de papel limpa.
Em seguida, coloque um rato no canto de uma câmara de reação. Para começar a filmar, clique no botão Iniciar captura na barra de menus do sistema de gravação de vídeo e registre o tempo. Mantendo silêncio na sala de testes, deixe o mouse se mover livremente por cinco minutos.
Em seguida, pare a gravação e salve o vídeo. Coloque o mouse de volta em sua gaiola. Em seguida, limpe a área de teste com etanol a 70% e prossiga para o próximo mouse.
Mantenha o rato eutanasiado plano em uma bandeja de dissecação e fixe as extremidades. Segure a pele do membro posterior no rato com fórceps e abra a pele e os músculos com uma tesoura. Em seguida, separe o fêmur da tíbia e do osso do quadril usando cuidadosamente a tesoura.
Remova os músculos aderentes ao fêmur com uma tesoura. Em seguida, coloque o fêmur em etanol a 70% à temperatura ambiente. Neste estudo, avaliou-se a capacidade do peptídeo derivado da glicoproteína oligodendrócitos da mielina de induzir EAE.
Ratos injetados com o peptídeo experimentaram perda de peso progressiva. Após seis a nove dias de injeção, eles desenvolveram sintomas de EAE que atingiram o pico após 14 a 16 dias. Gráficos de pista do teste de campo aberto demonstraram que o EAE altera o comportamento exploratório normal dos camundongos.
Em comparação com ratos normais, os ratos com EAE viajaram significativamente menos distância nas fases iniciais de início, pico e remissão. Camundongos com EAE também tiveram uma duração de atividade significativamente reduzida nas fases de pico e remissão da doença. Além disso, em todas as três fases, os camundongos EAE tiveram significativamente menos distância de viagem e tempo gasto no centro.
Tomografia computadorizada de fêmures de camundongos EAE revelou uma arquitetura trabecular diferente de camundongos normais. Os fêmures de camundongos EAE tiveram significativamente menos densidade mineral óssea e relação volume ósseo/volume tecidual do que aqueles de camundongos normais. Além disso, fêmures de camundongos com EAE apresentaram menor densidade de conexão trabecular, número trabecular e espessura trabecular do que aqueles de camundongos normais.
Em comparação com camundongos normais, o espaçamento trabecular foi aumentado e a espessura óssea cortical foi reduzida em camundongos EAE. Também podemos isolar o cérebro e o código espinhal de camundongos EAE no pico da doença e analisar a produção de células imunes e citocinas por citometria da gripe.
