يوفر هذا البروتوكول طريقا سهلا للوصول إلى عالم التصوير المقطعي الإلكتروني المبرد الذي يزداد شعبية ولكنه معقد. يمكن تصوير ست عينات خلوية. معهد في ولاية قريبة من السكان الأصليين.
يمكن بعد ذلك حل الجزيئات الدقيقة بدقة عالية في بيئتها الخلوية الأصلية باستخدام CROW و ET ومتوسط الذرة الفرعية. ابدأ بتشغيل برنامج Tomo Five من كمبيوتر خادم TEM. ابدأ الجلسة التي تم إعدادها عن طريق ضبط معلمات الحصول على الصورة في علامة التبويب "إعداد"، ضمن الإعدادات المسبقة.
انسخ معلمات الحصول على الصورة إلى جميع الإعدادات المسبقة الأخرى للتكبير العالي. اضغط على Set"لضبط التعرض للمجهر و Get"للحصول على إعدادات التعرض لجميع التكبيرات العالية الأخرى بعد تحديدها بشكل فردي. لجمع أطلس، انقر فوق علامة التبويب جلسة جديدة "في الأطلس".
قم بتعيين تفضيلات الجلسة. أدخل مسار التخزين وتنسيق الإخراج واضغط على تطبيق. حدد الفحص"وحدد جميع الأطالس التي سيتم الحصول عليها.
حدد إغلاق صمامات الاتصال"إذا كان المجهر غير خاضع للإشراف ، فسيؤدي ذلك إلى إغلاق صمامات العمود. ثم لبدء الفحص، اضغط على زر البدء. افحص الأطالس المفردة أو المتعددة بحثا عن الأهداف من خلال النقر على الشبكة في اللوحة اليمنى ضمن إعداد الجلسة"ثم انقر بزر الماوس الأيسر واسحب الماوس للتنقل والتمرير الأوسط للتكبير والتصغير.
اختر الشبكة لإعداد الهدف. حدده وانقر على تحميل عينة"من داخل البرنامج. لإجراء معايرة إزاحة الصورة، في علامة التبويب "وظائف تلقائية"اضبط الإعداد المسبق على ارتفاع Eucentric"انتقل إلى Auto-Eucentric" عن طريق إمالة المرحلة، ثم اضغط على زر البدء.
إذا ظلت الميزة متمركزة أثناء الاستهداف، فقم بتخطي معايرات إزاحة الصورة. وإلا، انتقل إلى علامة التبويب "إعداد" لمعايرة إزاحة الصورة، فحدد معايرة إزاحة الصورة"واضغط على زر البدء. سيؤدي ذلك إلى محاذاة التكبيرات المنخفضة مع الميزة المتمركزة عند تكبير التعريض الضوئي.
لإعداد التصوير المقطعي ، ابدأ جلسة جديدة في إعداد الجلسة "للعينات البيولوجية. اختر بلاطة مثل"كنوع العينة وحدد الدفعة"والجرعة المنخفضة"ثم حدد مجلد تنسيق الإخراج والتخزين". اختياريا، أضف مستلم بريد إلكتروني واضغط على تطبيق"لإعداد الأهداف، انتقل إلى سهم الأطلس، وابحث عن منطقة اهتمام وتحرك عن طريق تحديد الخيارات التي تنبثق بنقرة مارقة بزر الماوس الأيمن.
التقط صورة عامة لتأكيد وضع جيد لضبط الارتفاع Eucentric. ثم اضغط على autoeucentric"لتشغيل eucentric عن طريق روتين إمالة المرحلة ، واستعادة صورة نظرة عامة جديدة لتحديث ارتفاع eucentric. افحص نظرة عامة على المربع أو خريطة البحث التي تم الحصول عليها.
انتقل إلى منطقة ذات أهمية واضغط على البحث عن الاكتساب. ثم افحص صورة البحث إذا لم تكن المنطقة ذات الاهتمام متمركزة ، وانقر بزر الماوس الأيمن في الموضع المطلوب وكرر مرحلة النقل هنا"واحصل على صورة. اضبط مناطق التركيز والتتبع.
انقر بزر الماوس الأيسر لسحب مناطق التتبع والتركيز. بمجرد تعيين جميع المعلمات ، اضغط على إضافة موضع"لأداء وظائف تلقائية ، تحقق من الإعدادات لإجراء المحاذاة عبر علامة التبويب Auto Functions" عن طريق التنقل في الأطلس إلى منطقة من الكربون. اجلب هذه المنطقة إلى ارتفاع متمركز واتبع ترتيب المحاذاة كما هو موضح في مخطوطة النص.
بعد ذلك ، ابدأ الاكتساب التلقائي لعلامة التبويب التصوير المقطعي. حدد لوح الحصول على البيانات وقم بتعيين المعلمات المطلوبة. إعداد معلمات الحصول على البيانات: خطوة الإمالة ، أقصى زاوية إيجابية ، أقصى زاوية سالبة ، مخطط تتبع.
ثم حدد إغلاق صمامات العمود "لنظام الارتفاع eucentric. ابدأ بإعداد ملفات الإدخال والدلائل. إنشاء مجلد مشروع ضمن المجلد "المشروع".
قم بعمل مكدسات ثابتة لمجلد جديد آخر وقم بإعداد ملفات الإدخال. سلسلة الإمالة سلسلة إمالة ثابتة واحدة 1. XF وسلسلة الإمالة 1.tlt.
لحساب إلغاء التركيز البؤري، قم بتحديث ملف المعلمة باستخدام المجهر ومعلمات التصوير. نسخ ملف معلمة إلى مجلد المشروع. تغيير اسمها إلى param_CTF.
M وقم بتشغيل الأمر المشار إليه. بعد ذلك ، تحقق من نتائج تقدير CTF. لكل مكدس ، تحقق من المكدسات المحاذاة باستخدام 3D mod وتأكد من مسح الخرز الائتماني بشكل صحيح.
تأكد من صحة اليد عن طريق تشغيل الأمر المشار إليه. ثم تحقق من قيمة إلغاء التركيز البؤري وتأكد من مطابقتها لتقدير CTF النظري. لتحديد المناطق دون الإقليمية، قم بإنشاء تصوير مقطعي منحني.
في مجلد المشروع، قم بتشغيل الأمر المشار إليه. حدد الحدود عن طريق اختيار ست نقاط Xmin Xmax Ymin و Ymax و Zmin و Zmax ، لإنشاء منطقة فرعية واحدة ضمن ملف bin10 ، قم بتشغيل الأمر المشار إليه. بعد ذلك ، قم بتشغيل اختيار الجسيمات لكل منطقة دون إقليمية.
بالنسبة لمجموعة بيانات apoferritin ، قم بإجراء بحث عن القالب في bin six. تعديل زاوية تسطير القالب. معلمات البحث لتحديد الزاوية والمدى والفواصل الزمنية للبحث في المستوى أو خارج المستوى بالدرجات.
في مجلد المشروع قم بتشغيل الأمر المشار إليه. إزالة الجسيمات غير صحيحة باستخدام 3D mod تحت المجلد. Convmap_wedge_Type2_bin6. قم بتشغيل الأمر المشار إليه.
بعد ذلك، قم بتهيئة المشروع. في مجلد المشروع ، قم بتشغيل الأمر المشار إليه لإنشاء قاعدة بيانات لوضوح EM ، AppoF.mat. قم بإجراء إعادة بناء التصوير المقطعي قبل متوسط التومو الفرعي والمحاذاة لإنشاء صور مقطعية مصححة للمنطقة الفرعية CTF في bin4 ، قم بتشغيل الأمر المشار إليه.
بعد ذلك ، لإجراء متوسط ومحاذاة تومو فرعي ، قم بإجراء المتوسط باستخدام البرقيات الفرعية المصححة CTF بدءا من bin4. في مجلد المشروع، قم بتشغيل الأمر المشار إليه. استمر في إجراء المحاذاة وقم بتشغيل الأمر.
نظف الجسيمات المتداخلة عن طريق تشغيل الأمر المشار إليه. قم بإجراء إعادة الإعمار النهائية من خلال الجمع بين مجموعتي البيانات النصفيتين. في مجلد المشروع قم بتشغيل الأوامر المشار إليها.
يتم عرض نظرة عامة على سير عمل التصوير المقطعي للتصوير المقطعي الخلوي والجزيئي هنا للعينات الخلوية والصفائحية ، وتعتمد استراتيجية جمع البيانات إلى حد كبير على العينة والهدف من دراسة التصوير. يتم عرض معلمات المجموعة للعديد من دراسات cryo ET هنا. يتم عرض الصور المقطعية التمثيلية للعينات الجزيئية مثل الأبوفيريتين ، والعمليات الخلوية الرقيقة ، والصفيحة المطحونة بالحزمة الأيونية المركزة للعينة الخلوية السميكة هنا.
يمكن أن يساعد التحليل الهيكلي عالي الدقة في الكشف عن مواقع ملزمة لأهداف الأدوية ، كما ساعد التصوير المقطعي والمتوسط دون التوموغريال في تطوير لقاح ضد SARS-CoV-2.
