يتم وصف ثلاث طرق في هذا البروتوكول: جمع حبوب اللقاح القشرية باستخدام مصائد حبوب اللقاح ، وفرز حبوب اللقاح حسب اللون ، وتحلل الأسيتو. تستخدم هذه الطرق بشكل شائع في الدراسات المتعلقة بالملقحات ، مثل كفاءة التلقيح ، وديناميكيات البحث عن الملقحات ، وجودة النظام الغذائي وتنوعه. يعد اصطياد حبوب اللقاح طريقة سهلة لجمع كميات كبيرة من حبوب اللقاح من مستعمرات نحل العسل.
يعد فرز كريات حبوب اللقاح حسب اللون طريقة ميسورة التكلفة لتصنيف حبوب اللقاح التي تتطلب خبرة منخفضة ، ويسمح تحلل الأسيتوليز بتحديد تصنيف النبات المرتبط بكل لون حبيبة. ستوضح الإجراء إلين توبيتسوفر ، مساعدة أبحاث أعضاء هيئة التدريس ، وإميلي كارسون ، مساعدة أبحاث الدراسات العليا من مختبري. للبدء ، حدد متى تحبس حبوب اللقاح من موقع المنحل المطلوب وحدد مستعمرات نحل العسل المثلى لمحاصرة حبوب اللقاح.
قم بتقييم قوة المستعمرة عن طريق حساب العلافين العائدين إلى مدخل المستعمرة لمدة دقيقتين ثم حدد المستعمرات التي تحتوي على أكبر عدد إجمالي من العلافين العائدين. حدد خلايا النحل ذات الأواني الخشبية التي هي في حالة جيدة ، ويفضل أن يكون ذلك بدون مداخل إضافية وأغطية مشوهة. استخدم المستعمرات ذات المداخل البديلة الأقل ، حيث من المرجح أن يعيد النحل العلفي العائد إلى مثل هذه المستعمرات توجيهه إلى مدخل الفخ.
حدد مداخل الخلايا المواجهة للجنوب كلما أمكن ذلك. إذا تم وضع خلايا النحل على منصات نقالة ، فقم بتثبيت مصائد حبوب اللقاح على كل مستعمرة تواجه نفس الاتجاه على منصة نقالة معينة لتجنب انجراف العلف إلى مداخل الخلية المجاورة. إذا رغبت في ذلك ، قم بتقييم عش الحضنة للمستعمرة عن طريق فحص الإطارات بحثا عن وجود يرقات ومستعمرات مختارة بها كميات كبيرة نسبيا من اليرقات.
بعد ذلك ، قم بتثبيت مصائد حبوب اللقاح على مستعمرات نحل العسل المحددة. بالنسبة إلى مصائد التثبيت الأمامي، قم بتوصيل المصيدة أمام المدخل بالدبابيس والبراغي والشريط، أو قم بتوصيل المصيدة بأسلاك البنجي الملفوفة حول الخلية. أغلق جميع المداخل المحتملة الأخرى إلى المستعمرة بمادة غير لاصقة وقابلة للتشكيل ، مثل رغوة اللاتكس أو البولي يوريثان أو قطعة قماش الأجهزة رقم ثمانية لثقوب المثقاب.
استخدم الشريط اللاصق للشقوق الصغيرة. في حالة استخدام مصائد أمامية مثبتة على خلايا النحل على مستوى الأرض، ضع حاجزا مثل حصيرة مطاطية بين سلة التجميع والعشب لتجنب تلف الرطوبة من الندى. قم بتشغيل آلية الاصطياد الخاصة بمصيدة حبوب اللقاح بعد 24 ساعة من التثبيت وقبل بدء رحلة البحث عن الطعام اليوم.
جمع حبوب اللقاح كوربيكولار معينة من صينية التجميع ووضعها في أكياس بلاستيكية أو أنابيب الطرد المركزي ، ثم تخزينها في مبرد مع الثلج. استخدم المغرفة أو ملعقة كبيرة لإخراج 10 غرامات من حبوب اللقاح كعينة فرعية تمثيلية. قم بإزالة جميع أجزاء النحل والحطام من العينة الفرعية ، ثم قم بفرز كل حبيبة حبوب اللقاح من العينة الفرعية التي يبلغ وزنها 10 غرامات إلى مجموعة ألوان باستخدام كل من لون حبوب اللقاح وملمسها للتمييز بين المجموعات.
لضمان ما لا يقل عن 0.25 جرام من كل مجموعة ألوان للخطوات النهائية ، ضع أي كريات غير وفيرة بما يكفي لتشكيل مجموعة ألوان لا تقل عن 0.25 جرام في مجموعة متنوعة. قم بتسمية كل مجموعة ألوان فردية باستخدام دليل ألوان Pantone. وزن 0.25 غرام من كريات حبوب اللقاح من كل مجموعة لونية.
ارتد معدات الوقاية الشخصية المناسبة. ثم ، أضف ببطء 500 ميكرولتر من الحمض الحمضي الجليدي إلى كل أنبوب طرد مركزي صغير يحتوي على 0.25 جرام من حبوب اللقاح لمجموعة الألوان. أثناء فحص الأنبوب بصريا ، حرك حبوب اللقاح باستخدام مسواك نظيف لمدة 10 إلى 15 ثانية.
قم بالطرد المركزي للعينة لمدة ثلاث دقائق عند 1،100 مرة من الغرام ، ثم صب السوبر نات في كوب النفايات الحمضية. لتحضير خليط انحلال الأسيتوليس، أضف 10.8 ملليلتر من الحمض الحمضي الجليدي إلى خليط انحلال الأسيتوليز المسمى بالدورق. ثم ، أضف ببطء 1،200 ميكرولتر من حمض الكبريتيك المركز من محلول المخزون.
أضف ببطء 1000 ميكرولتر من خليط انحلال الأسيتوليز إلى كل أنبوب وحرك باستخدام مسواك نظيف لمدة 10 إلى 15 ثانية. ضع العينات على كتلة حرارة مسخنة مسبقا إلى 80 درجة مئوية. احتضن الأنابيب لمدة خمس دقائق ، مع تحريك كل أنبوب جيدا باستخدام مسواك نظيف في منتصف الطريق خلال الحضانة.
بعد الحضانة ، أضف ببطء 500 ميكرولتر من حمض الخليك الجليدي إلى كل أنبوب وحرك باستخدام مسواك نظيف لمدة 10 إلى 15 ثانية. قم بالطرد المركزي للعينات ، ثم صب supernatant من كل أنبوب في وعاء النفايات الحمضية. اشطف كل عينة ثلاث مرات بالماء عن طريق إضافة 1000 ميكرولتر من الماء المقطر إلى كل أنبوب وقم بالتحريك باستخدام مسواك نظيف.
الطرد المركزي للعينات وصب supernatant من الأنابيب في كوب من بيكربونات الصوديوم. ثم كرر شطف الماء مرتين أخريين. أضف 1000 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 95٪ من كوب الإيثانول إلى كل أنبوب وحرك باستخدام مسواك نظيف.
ثم ، الطرد المركزي للعينات وصب supernatant من الأنابيب إلى كوب نفايات الإيثانول. اخلطي محلول مرق البقعة safranin-O وأضيفي من 5 إلى 10 قطرات إلى كل أنبوب. يحرك المسواك لمدة 10 إلى 15 ثانية ويترك المسواك في الأنبوب.
أضف 1000 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 95٪ من كوب الإيثانول إلى كل أنبوب وحرك. بعد الطرد المركزي للعينات ، قم بصب supernatant في كوب نفايات الإيثانول. أضف 10 إلى 15 قطرة من الجلسرين إلى كل أنبوب وحرك المحتويات لمدة 10 إلى 15 ثانية.
اترك الأنابيب مفتوحة في غطاء الدخان لتبخير الإيثانول لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة المحيطة. تسمية شرائح المجهر لتحديد حبوب اللقاح. قم بإزالة قطرة واحدة من بقايا حبوب اللقاح من أنبوب وضعها في وسط شريحة المجهر الموسومة ، مما يسمح للقطرة بالانتشار قليلا.
ضع غطاء نظيفا فوق القطرة على الشريحة وأغلق الغطاء على الشريحة باستخدام طلاء أظافر شفاف. باستخدام الطرق الموصوفة ، تم جمع حبوب اللقاح القشرية ، وفرزها حسب اللون ، وتم تحديد المصادر النباتية لكل مجموعة ألوان بيليه لتقييم تنوع حبوب اللقاح. كان لكل عينة من عينات جمع حبوب اللقاح مجموعات ألوان متعددة يمكن تمييزها.
في بعض العينات، احتوت مجموعات ألوان حبوب اللقاح على ما لا يقل عن أربع إلى خمس كريات. ومع ذلك ، كان لدى معظم المجموعات أكثر من ذلك بكثير ، وكانت بمثابة مجموعة ألوان خاصة بها لتحلل الأسيتوليس. بعد انحلال الأسيتوليز ، تم استخدام المجهر الضوئي الساطع لتحديد كل مجموعة لونية بشكل فعال إلى أدنى مرتبة تصنيفية ممكنة من خلال تأكيد الخصائص المورفولوجية مع خصائص عينات القسائم التي تم جمعها من المنطقة المحيطة بكل موقع دراسة.
كان لحبوب اللقاح التي تم جمعها من مواقع محاصيل اللوز تنوع حبوب اللقاح أقل نسبيا من حبوب اللقاح التي تم جمعها من المحاصيل الأخرى ، بمتوسط ثلاثة ألوان بيليه في 3.2 أصناف نباتية لكل موقع يمكن اختبار حبوب اللقاح المصنفة للمبيدات الحشرية لتوضيح المواد الكيميائية الزراعية الموجودة في نباتات علف نحل العسل ، أو تحليلها للتركيب الكيميائي لتحديد قيمتها الغذائية لنحل العسل. قدمت نتائج هذا البحث رؤى قيمة حول تنوع الأنواع الذي لوحظ في حبوب اللقاح التي جمعتها المستعمرات ، مما يسلط الضوء على التنوع المنخفض بشكل كبير لحبوب اللقاح التي تم جمعها في أنظمة زراعة اللوز.
