Bu protokol, kriyo elektron tomografisinin giderek daha popüler ancak karmaşık dünyasına kolay bir erişim yolu sağlar. Altı hücresel örnek görüntülenebilir. Yerli devlete yakın bir enstitü.
Mikromoleküller daha sonra CROW, ET ve alt atom ortalaması kullanılarak doğal hücresel ortamlarında yüksek çözünürlükte çözülebilir. Tomo five yazılımını TEM sunucu bilgisayarından başlatarak başlayın. Ön ayarların altındaki hazırlık sekmesinde görüntü alma parametrelerini ayarlayarak oturum kurulumunu başlatın.
Görüntü alma parametrelerini diğer tüm yüksek büyütme ön ayarlarına kopyalayın. Mikroskopa pozlamayı ayarlamak için "Ayarla" ve tek tek seçtikten sonra pozlama ayarlarını diğer tüm yüksek büyütmelere almak için "Al" a basın. Bir atlas toplamak için, "Atlas" sekmesindeki "Yeni Oturum" a tıklayın.
Oturum tercihlerini ayarlayın. Depolama yolunu ve çıktı biçimini girin ve uygula'ya basın. Gösterim'i seçin ve edinilecek tüm atlasları işaretleyin.
Çağrı Vanalarını Kapat'ı Seç "Mikroskop denetimsizse, bu kolon valflerini kapatacaktır. Ardından gösterimi başlatmak için başlat düğmesine basın. Oturum Kurulumu" altındaki sol paneldeki ızgaraya tıklayarak hedefler için tek veya birden fazla atlası inceleyin, ardından hareket etmek için fareyi sol tıklayın ve sürükleyin ve yakınlaştırmak ve uzaklaştırmak için orta kaydırmayı yapın.
Hedef kurulum için ızgarayı seçin. Seçin ve yazılımın içinden "Yük Örneği" ne tıklayın. Görüntü kaydırma kalibrasyonunu gerçekleştirmek için, Otomatik İşlevler" sekmesinde ön ayarı Ösantrik Yükseklik"Otomatik Ösantrik Yüksekliğe Git"Sahne eğimine göre ayarlayın ve başlat düğmesine basın.
Hedefleme sırasında özellik ortalanmış olarak kalırsa, görüntü kaydırma kalibrasyonlarını atlayın. Aksi takdirde, görüntü kaydırmayı kalibre etmek için "Hazırlık" sekmesine gidin ve Görüntü Kaydırmayı Kalibre Et" i seçin ve başlat'a basın. Bu, daha düşük büyütmeleri, pozlama büyütmesinde ortalanan özelliğe hizalar.
Tomografi kurulumu için, biyolojik örnekler için "Oturum Kurulumu"nda yeni bir oturum başlatın. Örnek türü olarak "Levha" yı seçin ve Toplu ve Düşük Doz'u seçin"Ardından Çıktı formatı ve depolama" klasörünü seçin. İsteğe bağlı olarak, bir e-posta alıcısı ekleyin ve Uygula'ya basın"Hedefleri ayarlamak için atlas okuna gidin, ilgilendiğiniz bir bölge bulun ve sağ fare tıklamasıyla açılan seçenekleri belirleyerek hareket edin.
Ösentrik yükseklik ayarı için iyi bir pozisyonu onaylamak üzere bir genel bakış görüntüsü alın. Ardından, ösentrik eğim rutinine göre ösentrik çalıştırmak için "otoesantrik" tuşuna basın, ösentrik yüksekliği güncellemek için yeni bir genel bakış görüntüsü elde edin. Kareye genel bakışı veya edinilen arama haritasını inceleyin.
İlgilendiğiniz bir bölgeye gidin ve arama elde et'e basın. Ardından, ilgilenilen bölge ortalanmamışsa arama görüntüsünü inceleyin, istediğiniz konuma sağ tıklayın ve Aşamayı buraya taşı "ve görüntü elde edin. Odak ve izleme alanlarını ayarlayın.
İzleme ve odak alanlarını sürüklemek için sol tıklayın. Tüm parametreler ayarlandıktan sonra Konum Ekle'ye basın"Otomatik işlevleri gerçekleştirmek için, atlası bir karbon alanına yönlendirerek Otomatik İşlevler" sekmesi aracılığıyla hizalamaları gerçekleştirmek için ayarları kontrol edin. Bu alanı ösentrik yüksekliğe getirin ve metin el yazmasında açıklandığı gibi hizalama sırasını izleyin.
Ardından, tomografi sekmesinin otomatik olarak edinilmesini başlatın. Veri Toplama" levhasını seçin ve istediğiniz parametreleri ayarlayın. Veri toplama parametrelerini ayarlayın: eğim adımı, maksimum pozitif açı, maksimum negatif açı, izleme şeması.
Ardından, ösentrik yükseklik şeması için "Sütun Vanalarını Kapat" ı seçin. Giriş dosyalarını ve dizinleri hazırlayarak başlayın. Proje"klasörü altında bir proje klasörü oluşturun.
Başka bir yeni klasör sabit yığınları oluşturun ve giriş dosyalarını hazırlayın. Eğim serisi bir sabit eğim serisi 1. XF ve tilt serisi 1.tlt.
Bulanıklaştırmayı hesaplamak için, parametre dosyasını mikroskop ve görüntüleme parametreleriyle güncelleyin. Bir parametre dosyasını proje klasörüne kopyalayın. Adını param_CTF olarak değiştirin.
M'yi çalıştırın ve belirtilen komutu çalıştırın. Ardından, CTF tahmin sonuçlarını kontrol edin. Her yığın için, 3D modunu kullanarak hizalanmış yığınları kontrol edin ve referans boncuklarının doğru şekilde silindiğinden emin olun.
Belirtilen komutu çalıştırarak elinizin doğru olduğundan emin olun. Ardından bulanıklaştırma değerini kontrol edin ve teorik CTF tahminiyle eşleştiğinden emin olun. Alt bölgeleri tanımlamak için bir büküm tomogramı oluşturun.
Proje klasöründe, belirtilen komutu çalıştırın. Altı nokta seçerek sınırları belirleyin Xmin Xmax Ymin, Ymax, Zmin ve Zmax, bin10 klasörü altında bir alt bölge oluşturmak için belirtilen komutu çalıştırın. Ardından, her alt bölge için parçacık toplamayı çalıştırın.
Apoferritin veri kümesi için bin altıda bir şablon araması yapın. Şablon alt çizgi açısını değiştirin. Düzlem içi veya düzlem dışı aramanın açısını, aralığını ve aralıklarını derece cinsinden belirlemek için arama parametreleri.
Proje klasöründe belirtilen komutu çalıştırın. Klasörün altındaki 3D modunu kullanarak yanlış parçacıkları çıkarın. Convmap_wedge_Type2_bin6. Belirtilen komutu çalıştırın.
Ardından, projeyi başlatın. Proje klasöründe, EM netliği için AppoF.mat için bir veritabanı oluşturmak üzere belirtilen komutu çalıştırın. Bin4'te CTF düzeltilmiş alt bölge tomogramları oluşturmak için alt tomo ortalaması ve hizalamasından önce tomogram rekonstrüksiyonu gerçekleştirin, belirtilen komutu çalıştırın.
Daha sonra, alt tomo ortalamasını ve hizalamasını gerçekleştirmek için, bin4'ten başlayan CTF düzeltilmiş alt telgrafları kullanarak ortalamayı gerçekleştirin. Proje klasöründe, belirtilen komutu çalıştırın. Hizalamalar yapmaya devam edin ve komutu çalıştırın.
Belirtilen komutu çalıştırarak üst üste binen parçacıkları temizleyin. İki yarım veri kümesini birleştirerek son yeniden yapılandırmayı gerçekleştirin. Proje klasöründe belirtilen komutları çalıştırın.
Hücresel ve moleküler tomografi için tomografi iş akışına genel bakış, hücresel ve lamel örnekleri için burada gösterilmiştir, veri toplama stratejisi büyük ölçüde örneğe ve görüntüleme çalışmasının amacına bağlıdır. Birkaç kriyo ET çalışması için toplama parametreleri burada gösterilmiştir. Apoferritin, ince hücresel süreçler ve kalın hücresel numunenin odaklanmış iyon ışını öğütülmüş lamelleri gibi moleküler örneklerin temsili tomogramları burada gösterilmiştir.
Yüksek çözünürlüklü yapısal analiz, ilaç hedefleri için bağlanma bölgelerinin ortaya çıkarılmasına yardımcı olabilir ve tomografi ve sub-tomogral ortalama, SARS-CoV-2'ye karşı aşı geliştirmeye de yardımcı olmaktadır.
