باستخدام هذا البروتوكول ، قدمنا الطريقة الأولى القادرة على تحديد ملامح تعديلات الحمض النووي الريبي المتعددة في وقت واحد في الخلايا العصبية المفردة ، مما يفتح مجالات جديدة للتحقيق تنطوي على تنظيم ما بعد النسخ في الخلايا الفردية. من خلال الاستفادة من ظروف إعداد العينات المحسنة وقياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة ، يمكن اكتشاف أكثر من اثني عشر نيوكليوسيدات معدلة وتحديدها كميا في خلية عصبية واحدة لكل تجربة. تختلف الخلايا الفردية من حيث وظائفها ومورفولوجيتها وملامحها الكيميائية.
من المهم أن نكون قادرين على قياس الفسيفساء الكيميائية الكاملة لهذه الخلايا، بما في ذلك ملامح الحمض النووي الريبي الخاصة بها، حتى تتمكن الخلايا من فهم اختلافاتها، سواء في الصحة أو في المرض. يعتمد مدى تحضير العقد قبل عزل الخلايا العصبية المفردة على تفضيلات الفرد الذي يقوم بالعزلة. حاول استخدام علاجات الأنزيم البروتيني الأطول والأقصر لتحديد الظروف المناسبة.
للبدء ، ضع الجانب البطني Aplysia californica المخدر لأعلى في صينية تشريح. ابدأ في تشريحه باستخدام مقص جراحي مع طرف حاد واحد يوضع نحو الحيوان وقم بعمل قطع طولي بعناية عبر القدم. بعد تثبيت الجوانب السطحية والذيلية والجانبية لجسم الحيوان لفضح الأعضاء الداخلية والعقد العصبية المركزية في تجويف الجسم ، عزل العقد الرئيسية للجهاز العصبي المركزي عن الحيوان عن طريق قطع الأعصاب جراحيا وبعض الروابط الناشئة عن العقد.
اغمر العقد في 10 ملليغرام لكل محلول بروتياز من النوع الرابع عشر من العقدية من Streptomyces griseus واحتضنها لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة عند 34 درجة مئوية. بعد ذلك ، شطف العقد ست مرات بمحلول مضاد حيوي اصطناعي لمياه البحر. ثم باستخدام ماصة نقل البولي بروبيلين التي تم قطعها إلى فتحة خمسة ملليمترات ، قم بنقل جميع العقد إلى طبق مغطى ببوليمر السيليكون مملوء بمحلول المضادات الحيوية الاصطناعي لمياه البحر.
حافظ على العقد مغمورة دائما في مياه البحر الاصطناعية. بعد ذلك ، لإزالة أغماد العقدة ، قم بتثبيت العقد واستخدام المقص الدقيق والملقط الدقيق. مع العلاج الأنزيمي القوي بما فيه الكفاية ، استخدم إبر زجاجية أو معدنية لفك الغمد.
تحديد الخلايا العصبية المثيرة للاهتمام بصريا. باستخدام إبر شعرية زجاجية مجمعة أو إبر تنغستن حادة ، اعزل الخلية المحددة بعناية عن العقدة السائبة. بعد سحب حوالي ميكرولتر واحد من مياه البحر الاصطناعية إلى ماصة بلاستيكية ، انقل الخلية المعزولة إلى أنبوب عينة PCR يحتوي على أربعة ميكرولترات من 0.365 خلات الأمونيوم المولي.
للحصول على قياسات فارغة ، اجمع خمسة ميكرولتر من محلول المضادات الحيوية لمياه البحر الاصطناعي من الطبق الذي يحتوي على العقدة واخلطها مع المخزن المؤقت للهضم. قم بتحليل الخلايا العصبية المعزولة عن طريق الشفط المتكرر والاستغناء عن ماصة دقيقة في 0.365 خلات الأمونيوم المولية. قد لا تتمزق بعض الخلايا على الفور.
لتحليلها ، قم بالضغط عبر قطر الخلية باستخدام شعيرات شعرية زجاجية مجمعة. بعد ذلك ، قم بتسخين العينة في دورة حرارية قبل إضافة 3.375 ميكرولتر من مخزن هضم الحمض النووي الريبي إلى العينة. امزج هذا المحلول باستخدام ماصة دقيقة عن طريق سحب المحلول وتوزيعه عدة مرات.
قم بتدوير أي قطرات سائلة تتشبث بجدران أنبوب PCR باستخدام جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة. ثم احتضان العينات في الدورة الحرارية عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات ، تليها تعليق عند 10 درجات مئوية مع ضبط الغطاء الساخن على On.بمجرد أن تبرد العينات ، انقل على الفور سبعة ميكرولترات من المحلول إلى قارورة autosampler مجهزة بإدراج 250 ميكرولتر دون أي تكوين فقاعة في أنبوب أخذ العينات التلقائي. لإعداد نظام الكروماتوغرافيا السائلة لفصل النيوكليوسيدات الأساسية والمعدلة، قم بموازنة عمود C18 باستخدام 99٪ المرحلة المتنقلة A و 1٪ المرحلة المتنقلة B بمعدل تدفق 0.2 ملليلتر في الدقيقة لمدة 12 دقيقة عند 36 درجة مئوية.
قم بتشغيل أداة قياس الطيف الكتلي في الوضع الإيجابي مع ضبط صمام المحول على الهدر خلال الدقيقتين الأوليين من التحليل والمصدر لبقية الجري. ثم اجمع أطياف الكتلة على مدى m/z من 110 إلى 600. حدد الأيونات للتفكك الناجم عن الاصطدام عند 35 إلى 40 إلكترون فولت على مدى ثلاث دورات ثانية باستخدام قائمة كتلة مفضلة مبنية من قاعدة البيانات ونافذة عزل تبلغ 0.5.
استخدم الاستبعاد النشط لاستبعاد الأيونات من التجزئة بعد ثلاثة أطياف. قم بتعيين اكتساب أطياف MS/MS الديناميكية للأيونات ذات الكثافات التي تزيد عن 50،000 حساب عند أربعة هرتز وهرتز واحد على التوالي. والحد الأدنى لاختيار الأيونات عند 1،990 العد.
بالنسبة للتحليل الكمي لتعديل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية العصبية بواسطة قياس الطيف الكتلي ، قم ببناء منحنيات المعايرة باستخدام مناطق ذروة كروماتوغرام الأيونات المستخرجة التي تم الحصول عليها لمعايير النيوكليوزيد المعدلة بحد أدنى خمسة تركيزات للسماح بالاستيفاء لتركيزات التحليل الداخلي غير المعروفة. يتضمن تحليل تعديل الحمض النووي الريبي للخلايا العصبية المفردة بواسطة قياس الطيف الكتلي العزل اليدوي للخلايا العصبية المحددة في أحجام عينات صغيرة لهضم التحلل وتحليل LC-MS/MS. كشف تحليل تعديل الحمض النووي الريبي للخلية العصبية المفردة بواسطة قياس الطيف الكتلي بشكل روتيني عن أكثر من اثني عشر تعديلا للحمض النووي الريبي في الخلايا العصبية المفردة من الجهاز العصبي المركزي في Aplysia californica التي تمثل تغطية ما يقرب من نصف النسخ الفوقي المعروف لهذا الحيوان في خلية واحدة.
وكشفت النتائج لأول مرة أن ملامح تعديل الحمض النووي الريبي للخلايا المفردة يمكن أن تتباعد عن الخلايا السائبة في نفس الأنسجة. تم الحصول على مزيد من الدعم لأنماط النيوكليوزيد المعدلة الفريدة من نوعها من مجموعة منفصلة من الحيوانات حيث تم إجراء مقارنات زوجية ل 13 تعديلا للحمض النووي الريبي ، والتي تم اكتشافها عادة في كل من الخلايا العصبية المفردة والأنسجة السائبة. شكلت تعديلات الحمض النووي الريبي في خلايا مختلفة وظيفيا مجموعات فريدة في مخطط النتيجة بينما تجمعت الخلايا العصبية R2 / LPl1 المتماثلة.
وتبين مؤامرة التحميل أن الاختلافات كانت مدفوعة في المقام الأول بوفرة الأيزومرات الموضعية لميثيل أدينوزين، بما في ذلك 2'O-methyladenosineand و N1-methyladenosine. تم إنشاء منحنيات المعايرة الخارجية ل N1-methyladenosine و pseudouridine و 2'O-methylguanosine و 2'O-methyladenosine و N6-dimethyladenosine. وتم تحديد كمية كل نيوكليوسيد معدل في الخلايا ما وراء الدماغية وأزواج الخلايا R2 / LPl1 عن طريق الاستيفاء.
تأكد من نقل الحد الأدنى من حجم مياه البحر الاصطناعية إلى أنبوب PCR جنبا إلى جنب مع الخلايا العصبية المعزولة الواحدة. هذا يقلل من تخفيف العينة ، مما يؤثر في النهاية على الكشف التحليلي. يمكن استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في توزيعات تعديلات الحمض النووي الريبي في الهياكل دون الخلوية، مثل المحاور العصبية والتشعبات، لتحسين فهم آليات الترجمة المحلية المعتمدة على النشاط.
