Bu protokolle, tek nöronlarda birden fazla RNA modifikasyonunu aynı anda profilleyebilen ve bireysel hücrelerde transkripsiyon sonrası düzenlemeyi içeren yeni araştırma alanları açan ilk yöntemi tanıttık. Optimize edilmiş numune hazırlama koşullarından ve sıvı kromatografisi tandem kütle spektrometrisinden yararlanarak, deney başına tek bir nöronda bir düzineden fazla modifiye nükleozid tespit edilebilir ve ölçülebilir. Bireysel hücreler işlevleri, morfolojileri ve kimyasal profilleri açısından farklıdır.
RNA profilleri de dahil olmak üzere bu hücrelerin tam kimyasal mozaiğini ölçebilmemiz önemlidir, çünkü yeterli hücre hem sağlıkta hem de hastalıkta farklılıklarını anlayabilir. Tek nöron izolasyonundan önce gangliyon preparatının kapsamı, izolasyonu gerçekleştiren bireyin tercihlerine bağlıdır. Uygun koşulları belirlemek için hem daha uzun hem de daha kısa proteaz tedavilerini deneyin.
Başlamak için, anestezi uygulanan Aplysia californica ventral tarafını diseksiyon tepsisine yerleştirin. Künt bir ucu hayvana doğru yerleştirilmiş cerrahi makas kullanarak diseksiyona başlayın ve ayaktan uzunlamasına bir kesim dikkatlice yapın. Vücut boşluğundaki iç organları ve merkezi sinir sistemi gangliyonlarını açığa çıkarmak için hayvan vücudunun rostral, kaudal ve lateral taraflarını sabitledikten sonra, sinirleri ve ganglionlardan kaynaklanan bazı bağları cerrahi olarak keserek ana merkezi sinir sistemi gangliyonlarını hayvandan izole edin.
Ganglionları Streptomyces griseus'tan mililitre proteaz tip XIV çözeltisi başına 10 miligram içine daldırın ve 34 santigrat derecede 30 dakika ila bir saat arasında inkübe edin. Daha sonra, ganglionları yapay deniz suyu antibiyotik çözeltisi ile altı kez durulayın. Daha sonra beş milimetrelik bir açıklığa kesilmiş bir polipropilen transfer pipeti kullanarak, tüm ganglionları yapay deniz suyu antibiyotik çözeltisi ile doldurulmuş silikon polimer kaplı bir kaba aktarın.
Ganglionları her zaman yapay deniz suyuna batırılmış halde tutun. Daha sonra, ganglion kılıflarını çıkarmak için ganglionları sabitleyin ve mikromakas ve ince forseps kullanın. Yeterince güçlü enzimatik işlemle, kılıfı açmak için cam veya metal iğneler kullanın.
İlgilenilen nöronları görsel olarak tanımlayın. Havuzlanmış bir cam kılcal damar veya keskin tungsten iğneleri kullanarak, tanımlanan hücreyi toplu gangliondan dikkatlice izole edin. Plastik bir mikropipete yaklaşık bir mikrolitre yapay deniz suyu çektikten sonra, izole edilmiş hücreyi dört mikrolitre 0.365 molar amonyum asetat içeren bir PCR numune tüpüne aktarın.
Boş ölçümler için, ganglionu içeren çanaktan yapay deniz suyu antibiyotik çözeltisinin beş mikrolitrelik alikotunu toplayın ve sindirim tamponu ile karıştırın. İzole edilmiş nöronları tekrarlanan aspirasyon ve 0.365 molar amonyum asetat içinde bir mikropipet ile dağıtarak lize edin. Bazı hücreler hemen yırtılmayabilir.
Onları lize etmek için, havuzlanmış bir cam kılcal damar ile hücrenin çapı boyunca basınç uygulayın. Daha sonra, numuneye 3.375 mikrolitre RNA sindirim tamponu eklemeden önce numuneyi termal bir döngüde ısıtın. Bu çözeltiyi bir mikropipet kullanarak çözeltiyi birkaç kez çekip dağıtarak karıştırın.
Minyatür bir tezgah üstü santrifüj kullanarak PCR tüpünün duvarlarına yapışan sıvı damlacıklarını döndürün. Daha sonra numuneleri termal döngüde 37 santigrat derecede üç saat boyunca inkübe edin, ardından ısıtılmış kapak Açık olarak ayarlanmış 10 santigrat derecede tutun.Numuneler soğuduktan sonra, çözeltinin yedi mikrolitresini, otomatik numune alma tüpünde herhangi bir kabarcık oluşumu olmadan 250 mikrolitrelik bir kesici uç ile donatılmış bir otomatik numune alma şişesine derhal aktarın. Sıvı kromatografi sistemini kanonik ve modifiye nükleositlerin ayrılması için hazırlamak için, 36 santigrat derecede 12 dakika boyunca dakikada 0.2 mililitre akış hızında% 99 mobil faz A ve% 1 mobil faz B kullanarak bir C18 kolonunu dengeleyin.
Kütle spektrometresi cihazını, analizin ilk iki dakikası için boşa gidecek ve çalışmanın geri kalanı için kaynak sağlayacak şekilde saptırıcı valf ayarlanmış olarak pozitif modda çalıştırın. Daha sonra 110 ila 600 m / z aralığında kütle spektrumları toplayın. Veritabanından oluşturulan tercih edilen bir kütle listesi ve 0,5'lik bir izolasyon penceresi kullanarak üç saniyelik bir döngü süresi boyunca 35 ila 40 elektron voltta çarpışma kaynaklı ayrışma için iyonları seçin.
İyonları üç spektrumdan sonra parçalanmadan hariç tutmak için aktif dışlama kullanın. Yoğunlukları 50.000'in üzerinde ve altında olan iyonlar için dinamik MS / MS spektrumu alımını sırasıyla dört Hertz ve bir Hertz'de ayarlayın. Ve 1.990'da iyon seçimi için minimum bir eşik.
Kütle spektrometresi ile kantitatif tek nöron RNA modifikasyon analizi için, bilinmeyen endojen analit konsantrasyonlarının interpolasyonuna izin vermek için modifiye nükleozid standartları için en az beş konsantrasyonda elde edilen ekstrakte edilmiş bir iyon kromatogramı tepe alanlarını kullanarak kalibrasyon eğrileri oluşturun. Kütle spektrometresi ile tek nöron RNA modifikasyon analizi, tanımlanmış nöronların lizis sindirimi ve LC-MS / MS analizi için küçük numune hacimlerine manuel izolasyonunu içerir. Kütle spektrometresi ile tek nöron RNA modifikasyon analizi, Aplysia californica'nın merkezi sinir sisteminden tek nöronlarda bir düzineden fazla RNA modifikasyonunu rutin olarak tespit etti ve bu hayvanın bilinen epitranskriptomunun neredeyse yarısının tek bir hücrede kapsanmasını temsil etti.
Sonuçlar, ilk kez, tek hücrelerin RNA modifikasyon profillerinin aynı dokudaki toplu hücrelerden ayrılabileceğini ortaya koydu. Benzersiz modifiye nükleozid paternleri için daha fazla destek, hem tek nöronlarda hem de toplu dokuda yaygın olarak tespit edilen 13 RNA modifikasyonu için çift yönlü karşılaştırmaların yapıldığı ayrı bir hayvan kohortundan elde edildi. İşlevsel olarak farklı hücrelerdeki RNA modifikasyonları, skor grafiğinde benzersiz kümeler oluştururken, homolog R2 / LPl1 nöronları birlikte kümelenir.
Yükleme grafiği, farklılıkların öncelikle 2'O-metiladenozin ve N1-metiladenozin dahil olmak üzere metiladenozinin konumsal izomerlerinin bolluğundan kaynaklandığını göstermektedir. N1-metiladenosin, psödoüridin, 2'O-metilguanosin, 2'O-metiladenozin ve N6-dimetiladenozin için harici kalibrasyon eğrileri oluşturuldu. Metaserebral hücrelerdeki ve R2/LPl1 hücre çiftlerindeki her modifiye nükleozid miktarı interpolasyon ile belirlendi.
Minimum miktarda yapay deniz suyunun, tek izole nöron ile birlikte PCR tüpüne aktarıldığından emin olun. Bu, numune seyreltmesini en aza indirir ve sonuçta analit algılamasını etkiler. Bu protokol, aktiviteye bağımlı lokal translasyon mekanizmalarının anlaşılmasını geliştirmek için aksonlar ve dendritler gibi hücre altı yapılardaki RNA modifikasyonlarının dağılımlarını araştırmak için kullanılabilir.
