Avec ce protocole, nous avons introduit la première méthode capable de profiler simultanément plusieurs modifications d’ARN dans des neurones individuels, ouvrant de nouveaux domaines d’investigation impliquant la régulation post-transcriptionnelle dans des cellules individuelles. En tirant parti des conditions optimisées de préparation des échantillons et de la spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide, plus d’une douzaine de nucléosides modifiés peuvent être détectés et quantifiés dans un seul neurone par expérience. Les cellules individuelles sont différentes en termes de fonctions, de morphologie et de profils chimiques.
Il est important que nous soyons en mesure de mesurer la mosaïque chimique complète de ces cellules, y compris leurs profils d’ARN, pour que suffisamment de cellules comprennent leurs différences, à la fois dans la santé et dans la maladie. L’étendue de la préparation des ganglions avant l’isolement d’un seul neurone dépend des préférences de l’individu effectuant l’isolement. Essayez des traitements à la protéase plus longs et plus courts pour identifier les conditions appropriées.
Pour commencer, placez l’Aplysia californica anesthésiée côté ventral vers le haut dans un plateau de dissection. Commencez à le disséquer à l’aide de ciseaux chirurgicaux avec une pointe émoussée positionnée vers l’animal et faites soigneusement une coupe longitudinale à travers le pied. Après avoir épinglé les côtés rostral, caudal et latéral du corps animal pour exposer les organes internes et les ganglions du système nerveux central dans la cavité corporelle, isolez les principaux ganglions du système nerveux central de l’animal en coupant chirurgicalement les nerfs et certains conjonctifs provenant des ganglions.
Immerger les ganglions dans une solution de protéase de type XIV de 10 milligrammes par millilitre de Streptomyces griseus et incuber pendant 30 minutes à une heure à 34 degrés Celsius. Ensuite, rincez les ganglions six fois avec une solution antibiotique artificielle à l’eau de mer. Ensuite, à l’aide d’une pipette de transfert en polypropylène qui a été coupée à une ouverture de cinq millimètres, transférez tous les ganglions dans un plat recouvert de polymère de silicone rempli de la solution antibiotique artificielle d’eau de mer.
Gardez les ganglions toujours immergés dans de l’eau de mer artificielle. Ensuite, pour enlever les gaines ganglionnaires, épinglez les ganglions et utilisez des microcissives et des pinces fines. Avec un traitement enzymatique suffisamment résistant, utilisez des aiguilles en verre ou en métal pour le dégraissage.
Identifiez visuellement les neurones d’intérêt. À l’aide d’un capillaire en verre groupé ou d’aiguilles pointues en tungstène, isolez soigneusement la cellule identifiée du ganglion en vrac. Après avoir puisé environ un microlitre d’eau de mer artificielle dans une micropipette en plastique, transférer la cellule isolée dans un tube d’échantillonnage PCR contenant quatre microlitres d’acétate d’ammonium molaire 0,365.
Pour les mesures à blanc, prélever cinq aliquotes de microlitres de la solution antibiotique artificielle d’eau de mer de la boîte contenant le ganglion et mélanger avec le tampon de digestion. Lyser les neurones isolés par aspiration répétée et se passer d’une micropipette dans de l’acétate d’ammonium molaire 0,365. Certaines cellules peuvent ne pas se rompre immédiatement.
Pour les lyser, appliquez une pression sur le diamètre de la cellule avec un capillaire en verre mis en commun. Ensuite, chauffez l’échantillon dans un cycle thermique avant d’ajouter 3,375 microlitres de tampon de digestion de l’ARN à l’échantillon. Mélanger cette solution à l’aide d’une micropipette en retirant et en distribuant la solution plusieurs fois.
Faites tourner toutes les gouttelettes de liquide accrochées aux parois du tube PCR à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse miniature. Ensuite, incubez les échantillons dans le cycle thermique à 37 degrés Celsius pendant trois heures, suivi d’une retenue à 10 degrés Celsius avec le couvercle chauffé réglé sur On.Une fois les échantillons refroidis, transférez immédiatement sept microlitres de la solution dans un flacon d’échantillonneur automatique équipé d’un insert de 250 microlitres sans aucune formation de bulles dans le tube d’échantillonnage automatique. Pour préparer le système de chromatographie liquide à la séparation des nucléosides canoniques et modifiés, équilibrez une colonne en C18 en utilisant 99% de phase A mobile et 1% de phase B mobile à un débit de 0,2 millilitre par minute pendant 12 minutes à 36 degrés Celsius.
Utilisez l’instrument de spectrométrie de masse en mode positif avec la vanne de dérivation réglée sur le gaspillage pendant les deux premières minutes d’analyse et sur la source pour le reste de l’exécution. Collectez ensuite des spectres de masse sur une plage m/z de 110 à 600. Sélectionner des ions pour la dissociation induite par collision à 35 à 40 électronvolts sur un temps de cycle de trois secondes à l’aide d’une liste de masse préférée construite à partir de la base de données et d’une fenêtre d’isolement de 0,5.
Utilisez l’exclusion active pour exclure les ions de la fragmentation après trois spectres. Définissez l’acquisition dynamique des spectres MS/MS pour les ions dont les intensités sont supérieures et inférieures à 50 000 comptes à quatre Hertz et un Hertz, respectivement. Et un seuil minimum pour la sélection d’ions à 1 990 comptes.
Pour l’analyse quantitative de la modification de l’ARN d’un seul neurone par spectrométrie de masse, construisez des courbes d’étalonnage à l’aide d’une zone de pic de chromatogramme ionique extraite obtenue pour des étalons nucléosidiques modifiés à un minimum de cinq concentrations pour permettre l’interpolation de concentrations d’analyte endogènes inconnues. L’analyse de la modification de l’ARN d’un seul neurone par spectrométrie de masse implique l’isolement manuel des neurones identifiés en petits volumes d’échantillons pour la digestion par lyse et l’analyse LC-MS / MS. L’analyse de modification de l’ARN d’un seul neurone par spectrométrie de masse a systématiquement détecté plus d’une douzaine de modifications de l’ARN dans des neurones uniques du système nerveux central d’Aplysia californica, ce qui représente la couverture de près de la moitié de l’épitranscriptome connu de cet animal dans une seule cellule.
Les résultats ont révélé pour la première fois que les profils de modification de l’ARN des cellules individuelles pouvaient diverger des cellules en vrac dans le même tissu. Un soutien supplémentaire pour des modèles nucléosidiques modifiés uniques a été obtenu à partir d’une cohorte distincte d’animaux dans laquelle des comparaisons par paires ont été effectuées pour 13 modifications de l’ARN, couramment détectées à la fois dans les neurones individuels et les tissus en vrac. Les modifications de l’ARN dans des cellules fonctionnellement différentes ont formé des grappes uniques dans le diagramme de score tandis que les neurones homologues R2 / LPl1 co-clusterisés.
Le diagramme de charge montre que les différences étaient principalement dues à l’abondance d’isomères positionnels de méthyladénosine, y compris la 2'O-méthyladénosine et la N1-méthyladénosine. Des courbes d’étalonnage externes ont été générées pour la N1-méthyladénosine, la pseudouridine, la 2'O-méthylguanosine, la 2'O-méthyladénosine et la N6-diméthyladénosine. Et la quantité de chaque nucléoside modifié dans les cellules métacérébrales et les paires de cellules R2/LPl1 a été déterminée par interpolation.
Assurez-vous qu’un volume minimum d’eau de mer artificielle est transféré dans le tube PCR avec le seul neurone isolé. Cela minimise la dilution de l’échantillon, ce qui affecte finalement la détection des analytes. Ce protocole peut être utilisé pour étudier les distributions des modifications de l’ARN dans les structures subcellulaires, comme les axones et les dendrites, afin d’améliorer la compréhension des mécanismes de la traduction locale dépendante de l’activité.
