Con questo protocollo, abbiamo introdotto il primo metodo in grado di profilare simultaneamente più modifiche dell'RNA in singoli neuroni, aprendo nuove aree di indagine che coinvolgono la regolazione post-trascrizionale nelle singole cellule. Sfruttando le condizioni di preparazione del campione ottimizzate e la spettrometria di massa tandem per cromatografia liquida, oltre una dozzina di nucleosidi modificati possono essere rilevati e quantificati in un singolo neurone per esperimento. Le singole cellule sono diverse in termini di funzioni, morfologia e profili chimici.
È importante che siamo in grado di misurare il mosaico chimico completo di queste cellule, compresi i loro profili di RNA, affinché un numero sufficiente di cellule comprenda le loro differenze, sia in salute che in malattia. L'estensione della preparazione dei gangli prima dell'isolamento del singolo neurone dipende dalle preferenze dell'individuo che esegue l'isolamento. Tentare trattamenti di proteasi più lunghi e più brevi per identificare le condizioni adatte.
Per iniziare, posizionare il lato ventrale applysia californica anestetizzato verso l'alto in un vassoio di dissezione. Inizia a sezionarlo usando le forbici chirurgiche con una punta smussata posizionata verso l'animale e fai con attenzione un taglio longitudinale attraverso il piede. Dopo aver appuntato i lati rostrale, caudale e laterale del corpo animale per esporre gli organi interni e i gangli del sistema nervoso centrale nella cavità corporea, isolare i principali gangli del sistema nervoso centrale dall'animale tagliando chirurgicamente i nervi e alcuni connettivi provenienti dai gangli.
Immergere i gangli in 10 milligrammi per millilitro di proteasi di tipo XIV soluzione da Streptomyces griseus e incubare per 30 minuti a un'ora a 34 gradi Celsius. Quindi, risciacquare i gangli sei volte con una soluzione antibiotica artificiale di acqua di mare. Quindi, utilizzando una pipetta di trasferimento in polipropilene che è stata tagliata ad un'apertura di cinque millimetri, trasferire tutti i gangli in un piatto rivestito di polimeri siliconici riempito con la soluzione antibiotica artificiale di acqua di mare.
Tenere i gangli sempre immersi nell'acqua di mare artificiale. Successivamente, per rimuovere le guaine gangliari, fissare i gangli e utilizzare microscissori e pinze fini. Con un trattamento enzimatico sufficientemente forte, utilizzare aghi di vetro o metallo per sguainare.
Identificare visivamente i neuroni di interesse. Utilizzando un capillare di vetro raggruppato o aghi di tungsteno affilati, isolare accuratamente la cellula identificata dal ganglio sfuso. Dopo aver prelevato circa un microlitro di acqua di mare artificiale in una micropipetta di plastica, trasferire la cella isolata in una provetta di campionamento PCR contenente quattro microlitri di acetato di ammonio molare 0,365.
Per le misurazioni in bianco, raccogliere cinque aliquote di microlitro della soluzione antibiotica artificiale di acqua di mare dal piatto contenente il ganglio e mescolare con il tampone di digestione. Lisare i neuroni isolati mediante aspirazione ripetuta e rinunciando a una micropipetta in 0,365 acetato di ammonio molare. Alcune cellule potrebbero non rompersi immediatamente.
Per lisarli, applicare una pressione sul diametro della cella con un capillare di vetro raggruppato. Quindi, riscaldare il campione in un ciclo termico prima di aggiungere 3.375 microlitri di tampone di digestione dell'RNA al campione. Mescolare questa soluzione utilizzando una micropipetta ritirando ed erogando la soluzione più volte.
Far girare tutte le goccioline liquide aggrappate alle pareti del tubo PCR utilizzando una centrifuga da banco in miniatura. Quindi incubare i campioni nel ciclo termico a 37 gradi Celsius per tre ore, seguiti da una sospensione a 10 gradi Celsius con il coperchio riscaldato impostato su On.Una volta che i campioni si sono raffreddati, trasferire immediatamente sette microlitri della soluzione in un flaconcino per autocampionatore dotato di un inserto da 250 microlitri senza alcuna formazione di bolle nel tubo dell'autocampionatore. Per preparare il sistema di cromatografia liquida per la separazione dei nucleosidi canonici e modificati, equilibrare una colonna C18 utilizzando il 99% di fase mobile A e l'1% di fase B mobile ad una portata di 0,2 millilitri al minuto per 12 minuti a 36 gradi Celsius.
Azionare lo strumento di spettrometria di massa in modalità positiva con la valvola deviatrice messa a punto per i primi due minuti di analisi e alla fonte per il resto della corsa. Quindi raccogliere spettri di massa su un intervallo m / z da 110 a 600. Selezionare gli ioni per la dissociazione indotta dalla collisione a 35-40 elettronvolt in un ciclo di tre secondi utilizzando un elenco di massa preferito costruito dal database e una finestra di isolamento di 0,5.
Utilizzare l'esclusione attiva per escludere gli ioni dalla frammentazione dopo tre spettri. Impostare l'acquisizione dinamica degli spettri MS/MS per ioni con intensità superiori e inferiori a 50.000 conteggi rispettivamente a quattro Hertz e uno Hertz. E una soglia minima per la selezione degli ioni a 1.990 conteggi.
Per l'analisi quantitativa della modifica dell'RNA a singolo neurone mediante spettrometria di massa, costruire curve di calibrazione utilizzando aree di picco del cromatogramma ionico estratte ottenute per standard nucleosidici modificati ad un minimo di cinque concentrazioni per consentire l'interpolazione di concentrazioni di analiti endogeni sconosciuti. L'analisi di modifica dell'RNA a singolo neurone mediante spettrometria di massa comporta l'isolamento manuale dei neuroni identificati in piccoli volumi di campione per la digestione della lisi e l'analisi LC-MS/MS. L'analisi di modificazione dell'RNA a singolo neurone mediante spettrometria di massa ha rilevato di routine oltre una dozzina di modifiche dell'RNA in singoli neuroni del sistema nervoso centrale di Aplysia californica che rappresentano la copertura di quasi la metà dell'epitrastoma noto di questo animale in una singola cellula.
I risultati hanno rivelato per la prima volta che i profili di modifica dell'RNA delle singole cellule potrebbero divergere dalle cellule di massa nello stesso tessuto. Un ulteriore supporto per modelli nucleosidici modificati unici è stato ottenuto da una coorte separata di animali in cui sono stati eseguiti confronti a coppie per 13 modifiche dell'RNA, comunemente rilevate sia nei singoli neuroni che nel tessuto di massa. Le modifiche dell'RNA in cellule funzionalmente diverse hanno formato cluster unici nel grafico del punteggio mentre i neuroni Omologhi R2 / LPl1 si sono co-raggruppati.
Il diagramma di carico mostra che le differenze sono state principalmente guidate dall'abbondanza di isomeri posizionali di metildonesina, tra cui 2'O-metildidenosina e N1-metildidennosina. Sono state generate curve di calibrazione esterne per N1-metildenosina, pseudouridina, 2'O-metilguanosina, 2'O-metildidenosina e N6-dimetildiladenosina. E la quantità di ciascun nucleoside modificato nelle cellule metacerebrali e nelle coppie di cellule R2 / LPl1 è stata determinata per interpolazione.
Assicurarsi che un volume minimo di acqua di mare artificiale venga trasferito nel tubo PCR insieme al singolo neurone isolato. Ciò riduce al minimo la diluizione del campione, che alla fine influisce sul rilevamento dell'analita. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare le distribuzioni delle modificazioni dell'RNA in strutture subcellulari, come assoni e dendriti, per migliorare la comprensione dei meccanismi di traduzione locale dipendente dall'attività.
