이 프로토콜을 통해 우리는 단일 뉴런에서 여러 RNA 변형을 동시에 프로파일 링 할 수있는 첫 번째 방법을 도입하여 개별 세포에서 전사 후 조절과 관련된 새로운 조사 영역을 열었습니다. 최적화된 샘플 준비 조건 및 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광법을 활용함으로써, 수십 개 이상의 변형된 뉴클레오시드가 실험 당 단일 뉴런에서 검출되고 정량화될 수 있다. 개별 세포는 기능, 형태 및 화학적 프로파일면에서 다릅니다.
RNA 프로파일을 포함하여 이러한 세포의 완전한 화학 모자이크를 측정하여 건강과 질병 모두에서 차이점을 이해할 수있는 충분한 세포가 있어야합니다. 단일 뉴런 분리 이전의 신경절 준비의 범위는 격리를 수행하는 개인의 선호도에 달려 있습니다. 적합한 조건을 확인하기 위해 더 길고 짧은 프로테아제 치료를 모두 시도하십시오.
시작하려면 마취 된 Aplysia californica 복부 측면을 해부 트레이에 올려 놓습니다. 하나의 무딘 팁이 동물 쪽으로 위치된 외과 용 가위를 사용하여 해부하고 조심스럽게 발을 통해 세로 절단을 시작하십시오. 동물 신체의 로스트랄, 인과성 및 측면 측면을 고정시켜 체강 내 내부 장기와 중추 신경계 신경절을 노출시킨 후 신경절에서 유래 한 신경과 일부 연결을 외과 적으로 절단하여 주요 중추 신경계 신경절을 동물로부터 분리하십시오.
신경절을 스트렙토마이세스 그리세스로부터 밀리리터 프로테아제 타입 XIV 용액 당 10 밀리그램에 담그고 섭씨 34도에서 30분 내지 1시간 동안 인큐베이션한다. 다음으로, 인공 해수 항생제 용액으로 신경절을 여섯 번 헹구십시오. 그런 다음 다섯 밀리미터의 개구부로 절단 된 폴리프로필렌 전사 피펫을 사용하여 모든 신경절을 인공 해수 항생제 용액으로 채워진 실리콘 폴리머 코팅 접시로 옮깁니다.
신경절은 항상 인공 바닷물에 잠겨 있어야합니다. 다음으로, 신경절 외피를 제거하려면 신경절을 핀다운하고 미세 가위와 미세 포셉을 사용하십시오. 충분히 강한 효소 처리로 유리 또는 금속 바늘을 사용하여 피복을 벗기십시오.
관심있는 뉴런을 시각적으로 식별하십시오. 풀링 된 유리 모세관 또는 날카로운 텅스텐 바늘을 사용하여 확인 된 세포를 벌크 신경절에서 조심스럽게 분리하십시오. 약 한 마이크로리터의 인공 해수를 플라스틱 마이크로피펫으로 그린 후, 분리된 세포를 0.365몰 아세트산암모늄 4마이크로리터를 함유하는 PCR 샘플 튜브로 옮긴다.
빈 측정을 위해, 신경절이 들어있는 접시에서 인공 해수 항생제 용액의 다섯 마이크로 리터 분취량을 수집하고 소화 완충액과 혼합하십시오. 분리된 뉴런을 반복적인 흡인에 의해 용해시키고 0.365 몰 암모늄 아세테이트에 마이크로피펫으로 분배한다. 일부 세포는 즉시 파열되지 않을 수 있습니다.
그들을 용해하려면 풀링 된 유리 모세관으로 세포의 직경에 압력을 가하십시오. 다음으로, 3.375 마이크로리터의 RNA 소화 완충액을 샘플에 첨가하기 전에 샘플을 열 사이클에서 가열한다. 마이크로 피펫을 사용하여이 용액을 여러 번 꺼내고 분배하여 혼합하십시오.
소형 벤치 상단 원심분리기를 사용하여 PCR 튜브의 벽에 달라붙는 액체 방울을 회전시킵니다. 그런 다음 열 사이클에서 샘플을 섭씨 37도에서 3 시간 동안 인큐베이션한 다음 가열 된 뚜껑을 On으로 설정하여 섭씨 10도에서 유지하십시오.샘플이 냉각되면 즉시 7 마이크로 리터의 용액을 자동 시료 주입기 튜브에 거품이 형성되지 않은 250 마이크로 리터 삽입물이 장착 된 자동 시료 주입기 바이알로 옮깁니다. 정준 및 개질된 뉴클레오시드의 분리를 위한 액체 크로마토그래피 시스템을 제조하기 위해, 섭씨 36도에서 12분 동안 분당 0.2밀리리터의 유속으로 99%이동상 A 및 1%이동상 B를 사용하여 C18 컬럼을 평형화시킨다.
질량 분광계 장비를 포지티브 모드에서 작동시키고 전환기 밸브를 사용하여 분석의 처음 두 분 동안 낭비하고 나머지 실행 동안 소스로 설정합니다. 그런 다음 110 ~ 600의 m / z 범위에서 질량 스펙트럼을 수집하십시오. 3초 사이클 시간에 걸쳐 35 내지 40 전자 볼트에서의 충돌 유도 해리를 위해 선택된 이온은 데이터베이스로부터 구축된 바람직한 질량 리스트와 0.5의 격리 윈도우를 사용한다.
활성 제외를 사용하여 세 스펙트럼 후에 단편화에서 이온을 제외합니다. 50 이상 및 그 미만의 강도를 갖는 이온에 대해 동적 MS/MS 스펙트럼 수집을 설정하고, 각각 네 헤르츠와 하나의 헤르츠에서 000 카운트를 계산합니다. 및 1에서 이온 선택을 위한 최소 임계값을 1, 990 카운트한다.
질량 분광법에 의한 정량적 단일 뉴런 RNA 변형 분석을 위해, 미지의 내인성 분석물 농도의 보간을 허용하기 위해 최소 다섯 농도에서 변형된 뉴클레오시드 표준에 대해 수득된 추출된 이온 크로마토그램 피크 영역을 사용하여 보정 곡선을 구축한다. 질량 분광법에 의한 단일 뉴런 RNA 변형 분석에는 용해 소화 및 LC-MS/MS 분석을 위해 식별된 뉴런을 작은 샘플 부피로 수동으로 분리하는 작업이 포함됩니다. 질량 분광법에 의한 단일 뉴런 RNA 변형 분석은 Aplysia californica의 중추 신경계로부터의 단일 뉴런에서 십여 개의 RNA 변형을 통해 일상적으로 검출되어 단일 세포에서이 동물의 알려진 epitranscriptome의 거의 절반의 범위를 나타냅니다.
그 결과는 단일 세포의 RNA 변형 프로파일이 동일한 조직의 벌크 세포에서 갈라질 수 있다는 것을 처음으로 밝혀냈다. 독특한 변형된 뉴클레오시드 패턴에 대한 추가 지지체는 단일 뉴런 및 벌크 조직 둘 다에서 일반적으로 검출되는 13개의 RNA 변형에 대해 쌍 비교가 수행된 동물의 별개의 코호트로부터 얻어졌다. 기능적으로 상이한 세포에서의 RNA 변형은 스코어 플롯에서 독특한 클러스터를 형성하였고, 상동성 R2/LPl1 뉴런은 공동-클러스터링되었다.
로딩 플롯은 차이가 주로 2'O-메틸아데노신과 N1-메틸아데노신을 포함한 메틸아데노신의 위치 이성질체의 풍부함에 의해 주도되었다는 것을 보여준다. 외부 보정 곡선은 N1-메틸아데노신, 슈도우리딘, 2'O-메틸구아노신, 2'O-메틸아데노신, 및 N6-디메틸아데노신에 대해 생성되었다. 그리고 중뇌 세포 및 R2/LPl1 세포쌍에서 각각의 변형된 뉴클레오시드의 양은 보간법에 의해 결정되었다.
최소 부피의 인공 해수가 단일 분리된 뉴런과 함께 PCR 튜브로 전달되는지 확인하십시오. 이를 통해 시료 희석이 최소화되어 궁극적으로 분석물 검출에 영향을 미칩니다. 이 프로토콜은 축삭돌기 및 덴드라이트와 같은 세포 하부 구조에서 RNA 변형의 분포를 조사하여 활성 의존적 국소 번역의 메커니즘에 대한 이해를 향상시키는 데 사용할 수 있습니다.
