Mit diesem Protokoll haben wir die erste Methode eingeführt, die in der Lage ist, mehrere RNA-Modifikationen in einzelnen Neuronen gleichzeitig zu profilieren und neue Untersuchungsbereiche zu eröffnen, die die posttranskriptionelle Regulation in einzelnen Zellen betreffen. Durch die Nutzung optimierter Probenvorbereitungsbedingungen und der Tandem-Massenspektrometrie der Flüssigkeitschromatographie können über ein Dutzend modifizierte Nukleoside in einem einzigen Neuron pro Experiment nachgewiesen und quantifiziert werden. Einzelne Zellen unterscheiden sich in ihren Funktionen, ihrer Morphologie und ihren chemischen Profilen.
Es ist wichtig, dass wir in der Lage sind, das gesamte chemische Mosaik dieser Zellen, einschließlich ihrer RNA-Profile, zu messen, damit genügend Zellen ihre Unterschiede sowohl in der Gesundheit als auch in der Krankheit verstehen können. Das Ausmaß der Ganglienvorbereitung vor der Isolierung einzelner Neuronen hängt von den Präferenzen der Person ab, die die Isolierung durchführt. Versuchen Sie sowohl längere als auch kürzere Proteasbehandlungen, um geeignete Bedingungen zu identifizieren.
Legen Sie zunächst die betäubte Aplysia californica ventrale Seite nach oben in ein Seziertablett. Beginnen Sie, es mit einer chirurgischen Schere mit einer stumpfen Spitze zu sezieren, die in Richtung des Tieres positioniert ist, und machen Sie vorsichtig einen Längsschnitt durch den Fuß. Nachdem Sie die rostralen, kaudalen und lateralen Seiten des Tierkörpers gepinnt haben, um die inneren Organe und die Ganglien des zentralen Nervensystems in der Körperhöhle freizulegen, isolieren Sie die wichtigsten Ganglien des zentralen Nervensystems vom Tier, indem Sie die Nerven und einige Bindemittel, die von den Ganglien stammen, chirurgisch durchtrennen.
Tauchen Sie die Ganglien in 10 Milligramm pro Milliliter Protease Typ XIV Lösung aus Streptomyces griseus und inkubieren Sie für 30 Minuten bis eine Stunde bei 34 Grad Celsius. Als nächstes spülen Sie die Ganglien sechsmal mit künstlicher Meerwasser-Antibiotikalösung. Übertragen Sie dann mit einer Polypropylen-Transferpipette, die auf eine Öffnung von fünf Millimetern geschnitten wurde, alle Ganglien in eine silikonpolymerbeschichtete Schale, die mit der künstlichen Meerwasser-Antibiotikalösung gefüllt ist.
Halten Sie die Ganglien immer in künstliches Meerwasser getaucht. Als nächstes, um die Ganglienscheiden zu entfernen, stecken Sie die Ganglien fest und verwenden Sie eine Mikroschere und eine feine Pinzette. Verwenden Sie bei ausreichend starker enzymatischer Behandlung Glas- oder Metallnadeln zum Ummanteln.
Identifizieren Sie visuell die interessierenden Neuronen. Isolieren Sie die identifizierte Zelle vorsichtig mit einer gepoolten Glaskapillare oder scharfen Wolframnadeln vom Bulk-Ganglion. Nachdem Sie etwa einen Mikroliter künstliches Meerwasser in eine Kunststoff-Mikropipette gezogen haben, übertragen Sie die isolierte Zelle in ein PCR-Probenröhrchen, das vier Mikroliter 0,365 molare Ammoniumacetat enthält.
Für Leermessungen sammeln Sie fünf Mikroliter-Aliquots der künstlichen Meerwasser-Antibiotikalösung aus der Schale, die das Ganglion enthält, und mischen Sie es mit dem Verdauungspuffer. Lyse der isolierten Neuronen durch wiederholte Aspiration und Verzicht auf eine Mikropipette in 0,365 molaren Ammoniumacetat. Einige Zellen können nicht sofort reißen.
Um sie zu lysieren, üben Sie Druck über den Durchmesser der Zelle mit einer gepoolten Glaskapillare aus. Als nächstes erhitzen Sie die Probe in einem thermischen Zyklus, bevor Sie der Probe 3,375 Mikroliter RNA-Aufschlusspuffer hinzufügen. Mischen Sie diese Lösung mit einer Mikropipette, indem Sie die Lösung mehrmals zurückziehen und dosieren.
Drehen Sie alle Flüssigkeitströpfchen, die an den Wänden des PCR-Röhrchens haften, mit einer Miniatur-Tischzentrifuge ab. Dann inkubieren Sie die Proben im Thermozyklus bei 37 Grad Celsius für drei Stunden, gefolgt von einem Halt bei 10 Grad Celsius mit dem beheizten Deckel auf Ein.Sobald die Proben abgekühlt sind, übertragen Sie sofort sieben Mikroliter der Lösung in eine Autosampler-Durchstechflasche, die mit einem 250-Mikroliter-Einsatz ohne Blasenbildung im Autosampler-Röhrchen ausgestattet ist. Um das Flüssigkeitschromatographiesystem für die Trennung der kanonischen und modifizierten Nukleoside vorzubereiten, quilibrieren Sie eine C18-Säule mit 99% mobiler Phase A und 1% mobiler Phase B bei einer Durchflussrate von 0,2 Millilitern pro Minute für 12 Minuten bei 36 Grad Celsius.
Betreiben Sie das Massenspektrometriegerät im positiven Modus, wobei das Weichenventil für die ersten zwei Minuten der Analyse auf Abfall eingestellt und für den Rest des Laufs beschafft wird. Sammeln Sie dann Massenspektren über einen m/z-Bereich von 110 bis 600. Wählen Sie Ionen für die kollisionsinduzierte Dissoziation bei 35 bis 40 Elektronenvolt über eine Zykluszeit von drei Sekunden unter Verwendung einer aus der Datenbank erstellten bevorzugten Massenliste und eines Isolationsfensters von 0,5.
Verwenden Sie den aktiven Ausschluss, um Ionen nach drei Spektren von der Fragmentierung auszuschließen. Stellen Sie die dynamische MS/MS-Spektrenerfassung für Ionen mit Intensitäten über und unter 50.000 Zählern bei vier Hertz bzw. einem Hertz ein. Und eine Mindestschwelle für die Ionenauswahl bei 1.990 Zählungen.
Für die quantitative RNA-Modifikationsanalyse einzelner Neuronen mittels Massenspektrometrie konstruieren Sie Kalibrierkurven unter Verwendung eines extrahierten Ionenchromatogramms Peakbereiche, die für modifizierte Nukleosidstandards in mindestens fünf Konzentrationen erhalten wurden, um eine Interpolation unbekannter endogener Analytkonzentrationen zu ermöglichen. Die RNA-Modifikationsanalyse einzelner Neuronen mittels Massenspektrometrie beinhaltet die manuelle Isolierung identifizierter Neuronen in kleine Probenvolumina für die Lyseverdauung und LC-MS/MS-Analyse. Die RNA-Modifikationsanalyse einzelner Neuronen durch Massenspektrometrie detektierte routinemäßig über ein Dutzend RNA-Modifikationen in einzelnen Neuronen aus dem zentralen Nervensystem von Aplysia californica, die fast die Hälfte des bekannten Epitranskriptoms dieses Tieres in einer einzigen Zelle darstellen.
Die Ergebnisse zeigten zum ersten Mal, dass RNA-Modifikationsprofile einzelner Zellen von Massenzellen im selben Gewebe abweichen könnten. Weitere Unterstützung für einzigartige modifizierte Nukleosidmuster wurde von einer separaten Kohorte von Tieren erhalten, in der paarweise Vergleiche für 13 RNA-Modifikationen durchgeführt wurden, die üblicherweise sowohl in den einzelnen Neuronen als auch im Massengewebe nachgewiesen wurden. RNA-Modifikationen in funktionell unterschiedlichen Zellen bildeten einzigartige Cluster im Score-Plot, während homologe R2/LPl1-Neuronen ko-geclustert wurden.
Das Belastungsdiagramm zeigt, dass die Unterschiede in erster Linie durch die Häufigkeit von Positionsisomeren von Methyladenosin, einschließlich 2'O-Methyladenosin und N1-Methyladenosin, verursacht wurden. Externe Kalibrierkurven wurden für N1-Methyladenosin, Pseudouridin, 2'O-Methylguanosin, 2'O-Methyladenosin und N6-Dimethyladenosin erstellt. Und die Menge jedes modifizierten Nukleosids in den metazerebralen Zellen und R2 / LPl1-Zellpaaren wurde durch Interpolation bestimmt.
Stellen Sie sicher, dass ein minimales Volumen an künstlichem Meerwasser zusammen mit dem einzelnen isolierten Neuron in die PCR-Röhre übertragen wird. Dies minimiert die Verdünnung der Proben, was sich letztendlich auf den Analytnachweis auswirkt. Dieses Protokoll kann zur Untersuchung von Verteilungen von RNA-Modifikationen in subzellulären Strukturen wie Axonen und Dendriten verwendet werden, um das Verständnis der Mechanismen der aktivitätsabhängigen lokalen Translation zu verbessern.
