مع وجود حوالي 100 مليون خلية في دماغ الفأر وأحجام صور الدقة الخلوية للدماغ بالكامل تقترب من مقياس تيرابايت ، هناك حاجة إلى أدوات تحليل الصور المتقدمة لتحديد الخلايا بدقة. يمكن لخط الأنابيب الحسابي الخاص بنا معالجة الصور مسبقا وتحديد النوى داخل قشرة الماوس مع الحفاظ على حل وسط معقول بين دقة اكتشاف الخلايا ووقت التصوير والموارد الحسابية. سيكون عرض الإجراء فيليكس كير وإيان كيرتن ، طلاب الدراسات العليا من مختبري.
للبدء ، قم بتركيب العينة في حامل حجم العينة الصحيح بحيث يتم توجيه العينة بعمق لا يزيد عن 5.2 ملم بسبب مسافة العمل المقدرة لمجهر UltraMicroscope II. ثم أدخل الحامل في مهد العينة بحيث يكون برغي الحامل بزاوية 45 درجة إلى دعامات المهد. بعد ذلك ، ضع المهد في موضع بحيث يتم توجيه العينة بشكل عمودي على مسار الضوء.
بعد ذلك ، اضبط جسم التكبير / التصغير على المجهر على تكبير 4x أو أعلى ، مما ينتج عنه 0.75 ميكرومتر لكل بكسل. في برنامج Inspector Pro ، حدد ورقة إضاءة واحدة بقيمة فتحة عددية تبلغ 0.08 تقريبا. لضمان الحفاظ على الدقة المحورية على طول عرض الصورة، حدد التركيز البؤري الديناميكي الأفقي وقم بتطبيق عدد الخطوات الموصى به وفقا لطول موجة الليزر.
ثم اضبط التركيز الدقيق لكل قناة فيما يتعلق بقناة التسجيل وطاقة الليزر لكل قناة فيما يتعلق بخصائص القناة. بعد ذلك ، اضبط عرض الورقة الخفيفة على حوالي 50٪ لضمان توزيع طاقة الورقة على النحو الأمثل في البعد y لحجم العينة. بعد ذلك، قم بتعيين عدد اللوحات فيما يتعلق بحجم العينة مع تداخل موصى به بنسبة 15٪ بين البلاطات، والتقاط الصور لكل قناة بالتتابع لكل مكدس في موضع تجانب معين.
أولا ، قم بتنزيل وتثبيت مدير بيئة Conda لأدوات معالجة الصور Linux و NuMorph. في سطر الأوامر ، قم بتشغيل matlab و NM_setup. م من NuMorph لتنزيل وتثبيت حزم برامج تحليل الصور اللازمة للتحليل.
ثم حدد أسماء العينات وأدلة الإدخال والإخراج ومعلومات القناة ومعلمات تصوير الورقة الخفيفة عن طريق تحرير الملف NM_samples.m. لضبط الكثافة ، في NMp_template ، اضبط الضبط المكثف على صواب use_processed_images على أنه خطأ عند العمل مع مجموعة جديدة من الصور. بعد ذلك ، قم بتعيين save_images و save_samples على أنها صحيحة.
بعد ذلك، قم بتعيين تظليل التجانب إلى أساسي لتطبيق تصحيح التظليل باستخدام الخوارزمية الأساسية، أو يدوي لتطبيق تصحيح تظليل التجانب باستخدام قياسات من UltraMicroscope II بعرض ورقة ضوئية محددة. لمحاذاة قناة الصورة، في NMp_template، اضبط channel_alignment على true وقناة alignment_method إما على الترجمة أو المطاط. بعد ذلك ، قم بتعيين sift_refinement على أنها قيمة true والتداخل 0.15 لمطابقة تداخل البلاط أثناء التصوير.
لتشغيل خطوات المعالجة المسبقة في MATLAB، حدد اسم العينة واضبط التكوين على NM_config عينة عملية. ثم قم بتشغيل أي من خطوات المعالجة المسبقة عن طريق تحديد غرزة التكوين NM_process أثناء تحديد المرحلة باستخدام الكثافة أو المحاذاة أو الغرزة ، وتحقق من دليل الإخراج لملفات الإخراج لكل مرحلة من المراحل. ابدأ بصورة 3D Atlas وصورة تعليق توضيحي مرتبطة بها تعين كل voxel لبنية معينة.
قم بمحاذاة كل من صورة Atlas وملف التعليقات التوضيحية للتأكد من تطابقهما بشكل صحيح في الاتجاه الصحيح. بعد المحاذاة، قم بمعالجة الملفات في NuMorph لتحديد المدخلات كما هو موضح في المخطوطة عن طريق تنفيذ الأمر. في NMa_template ، اضبط resample_images على true و resample_resolution لمطابقة الأطلس.
ثم حدد رقم القناة المراد إعادة تشكيلها باستخدام resample_channels. بعد ذلك، اضبط register_images إلى صواب، وحدد atlas_file لمطابقة الملف في دليل Atlas، وقم بتعيين registration_parameters كافتراضي. ثم اضبط save_registered_images على true.
للكشف عن النوى وعدد الخلايا والتصنيف ، اضبط كلا من count_nuclei و classify_cells على أنهما صحيحان. ثم اضبط count_method على 3dunet min_intensity لتحديد حد أدنى للكثافة للكائنات المكتشفة. بعد ذلك ، اضبط classify_method على أي من العتبة التي تعتمد على شدة مضان غير خاضعة للإشراف في مواضع السنترويد ، أو SVM التي تصمم مصنف آلة متجه الدعم الخطي الخاضع للإشراف.
لتنفيذ خطوات التحليل في MATLAB، حدد اسم العينة واضبط التكوين على عينة تحليل NM_config. بعد ذلك، قم بتشغيل أي من خطوات التحليل عن طريق تحديد مرحلة التكوين NM_analyze أثناء تحديد المرحلة باستخدام إعادة التشكيل أو التسجيل أو العد أو التصنيف والتحقق من دليل الإخراج لملفات الإخراج لكل مرحلة من المراحل. في NMe_template، قم بتعيين التحديث إلى true و compare_structures_by إلى أي من الفهرسين.
ثم قم بتعيين ملف القالب وجدول الهيكل الذي يحدد جميع فهارس وهياكل البنية الممكنة لتقييمها مع تحديد عدد الخلايا وتصنيف نوع الخلية. أدت إزالة الأنسجة باستخدام بروتوكول iDISCO + وعلامات النوى الخاصة بطبقة الخلايا العصبية إلى مجموعات خلايا محددة بوضوح من الخلايا العصبية العليا والسفلى في القشرة المتساوية. كان عد الخلايا باستخدام NuMorph يعتمد على خطوات المعالجة المسبقة الناجحة التي تتضمن ضبط الكثافة ومحاذاة القناة والخياطة.
ومع ذلك ، قد تؤدي الأخطاء في خطوات المعالجة المسبقة إلى خياطة غير صحيحة ، مما يؤدي إلى محاذاة وخياطة غير صحيحة ، وبالتالي ينتج عنها صور ذات نمط داخل التركيز البؤري وخارج التركيز البؤري. من أجل حساب النوى من مناطق معينة من الدماغ ، سيتم تعليق الصور المخيطة باستخدام أطلس ، مما يسمح بتراكب التعليقات التوضيحية على مناطق الدماغ. تم الكشف عن النوى المركزية باستخدام نموذج U-Net ثلاثي الأبعاد مدرب في NuMorph مع حوالي 12 مليون نواة إجمالية كانت إيجابية TO-PRO-3 في القشرة المخية المتساوية مع حوالي 2.6 مليون نواة إيجابية في الدماغ و 1.6 مليون نواة إيجابية CTIP2.
تم اكتشاف حوالي 3.7 و 2.9 مليون نواة إجمالية إيجابية TO-PRO-3 في العقد القاعدية والقشرة المخية الحصينية ، على التوالي. ومع ذلك ، كانت الخلايا الإيجابية في الدماغ المكتشفة في هاتين المنطقتين من الدماغ ضئيلة ، وتم اكتشاف حوالي 1.5 فقط في أقل من مليون خلية إيجابية CTIP2 في كل من العقد القاعدية والقشرة المخية الحصينية. قم بإجراء فحوصات الجودة المرئية أثناء الاستحواذ لتحقيق تجزئة جيدة.
وقم بإعداد بيئة Conda بشكل صحيح لضمان عدم مواجهة أي أخطاء في تحليل المصب. بالإضافة إلى عد الخلايا ، يسمح خط الأنابيب هذا بالتكامل مع أدوات التجزئة الأخرى التي تقيس حجم الخلية وشكلها والتي يمكن بعد ذلك مقارنتها عبر مجموعات النمط الجيني. من خلال خط الأنابيب الخاص بنا ، يمكننا تحديد كيفية تغير تشريح الدماغ عند الدقة الخلوية ، مما يؤدي إلى تحديد أنواع الخلايا ومناطق الدماغ المهمة لخطر المرض.
