Mit rund 100 Millionen Zellen im Mausgehirn und Größen von Bildern mit Zellauflösung des gesamten Gehirns, die sich dem Terabyte-Bereich nähern, sind fortschrittliche Bildanalysewerkzeuge erforderlich, um Zellen genau zu quantifizieren. Unsere Computerpipeline kann Bilder vorverarbeiten und Kerne innerhalb des Mauskortex quantifizieren, während ein vernünftiger Kompromiss zwischen Zellerkennungsgenauigkeit, Bildgebungszeit und Rechenressourcen aufrechterhalten wird. Felix Kyere und Ian Curtin, Doktoranden aus meinem Labor, demonstrieren das Verfahren.
Montieren Sie zunächst die Probe im richtigen Probengrößenhalter so, dass die Probe aufgrund des Nennarbeitsabstands des UltraMicroscope II-Mikroskops mit der Z-Dimension nicht mehr als 5,2 Millimeter tief ausgerichtet ist. Führen Sie dann den Halter so in die Probenschale ein, dass die Schraube des Halters im 45-Grad-Winkel zu den Stützen der Halterung steht. Als nächstes platzieren Sie die Halterung in einer Position, in der die Probe senkrecht zum Lichtpfad ausgerichtet ist.
Stellen Sie anschließend den Zoomkörper des Mikroskops auf 4-fache Vergrößerung oder höher ein, was 0,75 Mikrometer pro Pixel ergibt. Wählen Sie in der Inspector Pro-Software ein einzelnes Lichtblatt mit einem numerischen Aperturwert von ca. 0,08 aus. Um sicherzustellen, dass die axiale Auflösung entlang der Breite des Bildes beibehalten wird, wählen Sie "Horizontale dynamische Fokussierung" und wenden Sie die empfohlene Anzahl von Schritten in Abhängigkeit von der Laserwellenlänge an.
Passen Sie dann den Feinfokus für jeden Kanal in Bezug auf den Registrierungskanal und die Laserleistung pro Kanal in Bezug auf die Kanaleigenschaften an. Als nächstes stellen Sie die Lichtblattbreite auf etwa 50% ein, um sicherzustellen, dass die Blattleistung optimal in der y-Dimension für die Probengröße verteilt wird. Legen Sie anschließend die Anzahl der Kacheln in Bezug auf die Größe der Stichprobe mit einer empfohlenen Überlappung von 15 % zwischen den Kacheln fest und erfassen Sie Bilder für jeden Kanal sequenziell für jeden Stapel an einer bestimmten Kachelposition.
Laden Sie zunächst Conda Environment Manager für Linux und NuMorph-Bildverarbeitungstools herunter und installieren Sie es. Führen Sie in der Befehlszeile matlab und NM_setup aus. m von NuMorph, um Softwarepakete für die Bildanalyse herunterzuladen und zu installieren, die für die Analyse benötigt werden.
Geben Sie dann Beispielnamen, Eingabe- und Ausgabeverzeichnisse, Kanalinformationen und Lightsheet-Bildgebungsparameter an, indem Sie die Datei NM_samples.m. Legen Sie für die Intensitätsanpassung in NMp_template intense die Anpassung auf true und use_processed_images auf false fest, wenn Sie mit einem neuen Satz von Bildern arbeiten. Legen Sie als Nächstes save_images und save_samples als true fest.
Setzen Sie als Nächstes die Kachelschattierung auf einfach, um die Schattierungskorrektur mit dem Basisalgorithmus anzuwenden, oder manuell, um die Kachelschattierungskorrektur unter Verwendung von Messungen des UltraMicroscope II bei bestimmten Lichtblattbreiten anzuwenden. Legen Sie für die Ausrichtung des Bildkanals in NMp_template channel_alignment auf true und Kanal alignment_method entweder auf Translation oder Elastics fest. Legen Sie als Nächstes sift_refinement auf true und den Überlappungswert 0,15 fest, um die Kachelüberlappungen während der Abbildung abzugleichen.
Um Vorverarbeitungsschritte in MATLAB auszuführen, geben Sie den Beispielnamen an und legen Sie die Konfiguration auf NM_config Prozessbeispiel fest. Führen Sie dann einen der Vorverarbeitungsschritte aus, indem Sie NM_process Konfigurationsstich angeben, während Sie die Stufe mit Intensität, Ausrichtung oder Stitch angeben, und überprüfen Sie das Ausgabeverzeichnis auf Ausgabedateien für jede der Stufen. Beginnen Sie mit einem 3D-Atlasbild und einem zugehörigen Anmerkungsbild, das jedes Voxel einer bestimmten Struktur zuweist.
Richten Sie sowohl das Atlas-Bild als auch die Anmerkungsdatei aus, um sicherzustellen, dass sie in der richtigen Ausrichtung korrekt übereinstimmen. Nach dem Ausrichten verarbeiten Sie die Dateien in NuMorph, um die Eingaben wie im Manuskript beschrieben zu spezifizieren, indem Sie den Befehl ausführen. Setzen Sie resample_images NMa_template auf true und resample_resolution auf Übereinstimmung mit dem Atlas.
Geben Sie dann die Kanalnummer an, die mit resample_channels neu berechnet werden soll. Legen Sie anschließend register_images auf true fest, geben Sie die atlas_file an, die mit der Datei im Atlas-Verzeichnis übereinstimmen soll, und legen Sie registration_parameters als Standard fest. Setzen Sie dann save_registered_images auf true.
Legen Sie für die Zellkernerkennung, Zellzählung und Klassifizierung sowohl count_nuclei als auch classify_cells als true fest. Legen Sie dann die count_method auf 3dunet und min_intensity fest, um einen Mindestintensitätsschwellenwert für erkannte Objekte zu definieren. Als nächstes setzen Sie classify_method entweder auf einen Schwellenwert, der auf einer nicht überwachten Fluoreszenzintensität an Schwerpunktpositionen basiert, oder auf SVM, der einen überwachten linearen Unterstützungsvektor-Maschinenklassifikator modelliert.
Um Analyseschritte in MATLAB auszuführen, geben Sie den Probennamen an und legen Sie die Konfiguration auf NM_config Analyseprobe fest. Führen Sie als Nächstes einen der Analyseschritte aus, indem Sie NM_analyze Konfigurationsphase angeben, während Sie die Phase mithilfe von Resample, Register, Count oder Classify angeben und das Ausgabeverzeichnis auf Ausgabedateien für jede der Phasen überprüfen. Legen Sie NMe_template update auf true und compare_structures_by auf einen der beiden Indizierungen fest.
Legen Sie dann die Vorlagendatei und die Strukturtabelle fest, die alle möglichen Strukturindizes und -strukturen angibt, die ausgewertet werden sollen, während Sie die Zellzählung und die Zelltypklassifizierung angeben. Die Gewebereinigung mit dem iDISCO+-Protokoll und neuronalen schichtspezifischen Zellkernmarkern führte zu klar definierten Zellgruppen von Neuronen der oberen und unteren Schicht im Isokortex. Die Zellzählung mit NuMorph war abhängig von erfolgreichen Vorverarbeitungsschritten mit Intensitätsanpassung, Kanalausrichtung und Stitching.
Fehler in den Vorverarbeitungsschritten können jedoch zu unsachgemäßem Stitching führen, was zu einer falschen Ausrichtung und Platzierung und damit zu Bildern mit unscharfen und unscharfen Mustern führt. Um Kerne aus bestimmten Hirnregionen zu zählen, werden die zusammengefügten Bilder mit Atlas annotiert, so dass Anmerkungen auf Hirnregionen gelegt werden können. Die Zentroide der Kerne wurden mit einem trainierten 3D-U-Net-Modell in NuMorph mit rund 12 Millionen Gesamtkernen nachgewiesen, die TO-PRO-3-positiv im Isokortex mit etwa 2,6 Millionen Gehirn-zwei-positiven und 1,6 Millionen CTIP2-positiven Kernen waren.
Es wurden etwa 3,7 bzw. 2,9 Millionen TO-PRO-3-positive Gesamtkerne in den Basalganglien und im Hippocampus-Allocortex nachgewiesen. Die Gehirn-zwei-positiven Zellen, die in diesen beiden Gehirnregionen nachgewiesen wurden, waren jedoch vernachlässigbar, und nur etwa 1,5 von weniger als einer Million CTIP2-positiven Zellen wurden jeweils in den Basalganglien und im Hippocampus-Allocortex nachgewiesen. Führen Sie visuelle Qualitätsprüfungen während der Erfassung durch, um eine gute Segmentierung zu erreichen.
Und richten Sie die Conda-Umgebung ordnungsgemäß ein, um sicherzustellen, dass bei einer nachgelagerten Analyse keine Fehler auftreten. Zusätzlich zur Zellzählung ermöglicht diese Pipeline die Integration mit anderen Segmentierungswerkzeugen, die Zellgröße und -form messen, die dann über Genotypgruppen hinweg verglichen werden können. Mit unserer Pipeline können wir identifizieren, wie sich die Anatomie des Gehirns bei zellulärer Auflösung verändert, was zur Identifizierung von Zelltypen und Gehirnregionen führt, die für das Krankheitsrisiko wichtig sind.
